本研究使用SNP-index和ED算法对BSA-seq数据进行分析,将抗药性相关基因定位在辣椒疫霉基因组scaffold12和scaffold14上;然后结合DARTS研究结果,成功筛选获得8个候选药剂靶标蛋白(图1)。
进一步测序和比对分析了15株辣椒疫霉抗药性突变体及其敏感亲本菌株中的候选蛋白编码基因的序列,发现V-ATPase的a亚基(VHA-a)在所有抗性突变体中均发生了氨基酸位点突变。
进而使用CRISPR/Cas9介导的定点编辑技术,证明了PcVHA-a上4种点突变类型(G767E,N771Y,N846S,K847R)均可导致辣椒疫霉对氟吡菌胺产生抗性(图2)。进一步通过分子对接、V-ATPase酶活测定以及DARTS方法明确了VHA-a为氟吡菌胺和同类药剂氟醚菌酰胺的作用靶标蛋白。
图1 利用BSA-seq方法和优化的DARTS方法鉴定氟吡菌胺的靶标蛋白
图2 PcVHA-a上四种位点突变均能够引起辣椒疫霉对氟吡菌胺产生抗性
