

图1 AtF6’ H1的短暂过表达会导致东莨菪素的积累
接下来,研究人员分析了香豆素在稳定过表达AtF6’ H1的拟南芥中的积累。研究发现,转基因拟南芥和大豆之间存在明显的差异。拟南芥叶片无论正面还是背面在紫外光下都显示出强烈的东莨菪内酯荧光(图二)。相比之下,转基因大豆叶片的只有背面在紫外光下显示出强烈的荧光(图二)。拟南芥叶中的东莨菪碱浓度是大豆的5倍,最大分别为~370µg /g FW 和~ 80µg /g FW (图二)。
转基因拟南芥和大豆事件的叶片中东莨菪内酯含量相似,平均含量约为~ 3µg /g FW。在未转化的拟南芥和大豆叶片中未检测到或仅检测到少量东莨菪素和东莨菪素。另外,在过表达 AtF6’ H1的拟南芥根中,东莨菪内酯(8-9µg /g FW)和东莨菪素(440-490µg /g FW)水平远高于转基因大豆根(~ 0.5µg /g FW 东莨菪内酯和~ 25µg /g FW 东莨菪内酯)( 图二)。同时,转基因拟南芥中香豆素丰度也普遍高于大豆叶片和根。

图2 AtF6' H1在拟南芥和大豆中的稳定过表达导致香豆素积累
接下来,研究发现当细胞损伤时,细胞内的东莨菪碱似乎很快转化为东莨菪内酯。由于东莨菪内酯和东莨菪碱对植物的健康具有保护作用,研究者研究了拟南芥野生型,AtF6' H1突变体和AtF6'H1过表达材料对胞囊线虫(BCN)的敏感性。研究发现,当大于200µg /g FW东莨菪碱的AtF6'H1过表达材料中,雌性和雄性线虫的感染率有明显的降低。接下来,研究者分析了未转化和AtF6'H1过表达的大豆植株与F. virguliforme的相互作用。
接种后14天,非转基因植株和转基因植株的根都显示出腐烂,表明成功地感染了绿色镰刀菌(图三)。根系中的F. virguliforme感染也严重影响了两种基因型的茎部生物量(图三)。
与野生型相比,转基因植物的F. virguliforme的根中DNA丰度略低,但差异无统计学意义(图三)。与这些发现表明,东莨菪素在体外浓度低于500µM时对F. virguliforme菌丝的生长没有显著抑制。这些结果表明,过量表达AtF6' H1并不能直接保护大豆免受F. virguliforme的侵染,而是减轻了 SDS 对植株的损伤。因此,香豆素在大豆体内的积累似乎可以诱导大豆对 SDS 病害的耐受性。最后,研究者也发现香豆素在AtF6' H1过表达细胞中的积累减弱了真菌毒素诱导的ROS 积累和细胞死亡。

图3 大豆稳定过表达AtF6' H1诱导SDS耐受性
总得来说,香豆素可以对抗病原体,因此有望用于农作物保护。然而,它们的生物合成尚未在作物中进行基因改造。研究者分析了香豆素在转基因烟草、大豆和拟南芥植物以及红花烟草 BY-2悬浮细胞中的组成性积累。
通过过表达拟南芥AtF6' H1,编码东莨菪内酯生物合成的关键酶。拟南芥根中东莨菪碱含量高,与其对根寄生线虫的敏感性降低相一致。此外,转基因大豆植株对土传致病真菌F. virguliforme的耐受性较强。由于AtF6' H1过表达活性氧类减少了真菌毒素诱导的细胞积聚和细胞死亡。总之,工程香豆素积累有希望提高作物的抗病能力。