小麦是全球约30%人口的主要粮食作物，小麦生产受到各种真菌病害的威胁，如白粉病、锈病和赤霉病等。小伞山羊草（Aegilops umbellulata，2n=2x=14，UU）是小麦族山羊草属的二倍体野生物种，对多种小麦病原菌具有抗性，是小麦遗传改良的重要基因资源。然而，远缘杂交不亲和和连锁累赘限制了小伞山羊草优异外源基因向小麦的转移与利用，且外源染色体和小麦染色体之间的交换抑制阻碍了外源基因的克隆。以小伞山羊草等基因组较小的二倍体野生物种为研究对象，可以有效规避六倍体小麦基因组的复杂性，实现外源基因的快速发掘和克隆，为小麦抗病育种提供基因资源。
2024年8月22日，江苏大学何华纲团队联合中国科学院分子植物科学卓越创新中心王亚军团队在Plant Communications上在线发表了题为“An integrated pipeline facilitates fast cloning of a new powdery mildew resistance gene from the wheat wild relative Aegilops umbellulata ”的研究论文。该研究在种质资源调查的基础上，综合运用BSR-Seq分析、精细遗传作图、低深度PacBio测序和基因组组装等手段，从小伞山羊草中克隆了小麦抗白粉病新基因PmAeu1，为该基因的育种利用奠定了基础，也为小麦外源基因的挖掘和快速克隆提供了借鉴。
研究人员首先对52份小伞山羊草进行白粉病抗性鉴定，发现36份种质高抗小麦白粉病，利用对白粉病免疫的AE 1617与高感的AE 538构建了遗传作图群体。接着对253个F2单株进行白粉病鉴定，发现194个单株抗病，59个单株感病，符合理论值3:1（χ2=0.381，P=0.537）。从8个分离的F3家系中，鉴定出774个抗病单株和246个感病单株，也符合3:1（χ2=0.424，P=0.515）。这些结果表明，小伞山羊草AE 1617对小麦白粉病的抗性受到一个显性基因控制，将其命名为PmAeu1。
利用分离的F3家系中的抗病和感病单株分别构建抗、感混池，进行BSR-Seq分析，将PmAeu1初步定位在2U染色体的长臂（2UL）。根据覆盖显著峰的17.5 Mb区间内的SNP/InDel开发了五个KASP标记和两个CAPS标记，对74个感病的F3植株进行基因分型，将PmAeu1定位到分子标记X2U-4和X2U-6之间，该区间包含了19个重组事件。接着利用这两个标记从172个感病的F3植株中筛选到20个重组事件。对先后获得的39个交换单株进行基因分型，将PmAeu1精细定位到分子标记X2U-4.4和X2U-5B之间，对应了小伞山羊草TA 1851参考基因组中326 Kb物理区间。
调查发现TA 1851是一个感白粉病种质，推测TA 1851缺乏PmAeu1位点或者携带一个不具备功能的等位基因。因此，为了克隆PmAeu1，研究人员对小伞山羊草抗病品系AE 1617进行PacBio HiFi长读长测序，获得了约57.2 Gb的HiFi reads，覆盖率约为TA1851 基因组（4.25 Gb）的13.5倍。通过组装获得了2211个contig（N50为5.43 Mb；总长度为4.29 Gb），其中ptg000283l（14.41 Mb）覆盖了分子标记X2U-4.4和X2U-5B之间的287 kb区间。从PacBio测序数据中随机提取子集，发现8-10倍覆盖率的基因组数据可以覆盖PmAeu1位点，为PmAeu1的克隆提供有效的参考基因组。
为了快速鉴定PmAeu1，研究人员将抗、感池的RNA-Seq reads与AE 1617基因组进行了比对，将PmAeu1缩小到一个11 kb区域，该区域在感池中没有reads映射，而在抗池中具有较高的映射深度，涉及三个具有相同编码序列的转录本异构体，编码一个CC-NB-LRR类NLR蛋白，与已鉴定的抗白粉病的NLR蛋白序列一致性低于35%。将这个候选基因命名为AeuNLR1，由其开发的分子标记XAeuNLR1只在抗病亲本AE 1617中具有特异性产物，且在作图群体中与抗性共分离。使用农杆菌介导法创制了自身启动子控制的AeuNLR1转基因小麦，发现5个阳性的转基因植株在T0代和T1代都高抗白粉病，从而证实AeuNLR1就是目的基因PmAeu1。
研究人员还利用标记XAeuNLR1在20个抗病和1个感病小伞山羊草品系中检测到了PmAeu1位点。PCR扩增全长基因后进行Sanger测序，揭示了8个PmAeu1等位基因。其中，具有抗白粉病功能的PmAeu1a（PmAeu1）存在于11个抗病品系。在抗病品系AE1070和AE1339中的等位基因PmAeu1b和PmAeu1c也可编码完整的NLR蛋白，可能是功能性等位基因。在剩余的7个抗病品系和1个感病品系（PI554417）中发现了5个非功能性的等位基因PmAeu1d–PmAeu1h，它们具有1-2个碱基的移码插入或缺失。由此可见，PmAeu1位点至少可以解释小伞山羊草中30.4%（11/36）的白粉病抗性。
江苏大学何华纲副教授为第一作者兼通讯作者，江苏大学硕士研究生王甲乐、中国科学院分子植物科学卓越创新中心硕士研究生Jiabao Liang为论文共同第一作者，江苏大学朱姗颖副教授、中国科学院分子植物科学卓越创新中心王亚军研究员为共同通讯作者，湖北省农业科学院薛敏峰等参与了部分工作。该研究得到江苏省自然科学基金、国家自然科学基金等项目的支持。
He, H., Wang, J., Liang, J., Zhang, Q., Xue, M., Chen, Z., Tang, Q., Chen, X., Zhu, S., Wang, Y (2024). An integrated pipeline facilitates fast cloning of a new powdery mildew resistance gene from the wheat wild relative Aegilops umbellulata. Plant Commun. https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.101070.
Wang, Y., Abrouk, M., Gourdoupis, S., Koo., D., Karafiátová, M., Molnár, I., Holušová, K., Doležel, J., Athiyannan, N., Cavalet-Giorsa, E., et al. (2023). An unusual tandem kinase fusion protein confers leaf rust resistance in wheat. Nat. Genet. 55:914–920.
Zhu, S., Liu, C., Gong, S., Chen, Z., Chen, R., Liu, T., Liu, R., Du, H., Guo, R., Li, G., et al. (2023). Orthologous genes Pm12 and Pm21 from two wild relatives of wheat show evolutionary conservation but divergent powdery mildew resistance. Plant Commun. 4:100472.