Scheme3.Industrial synthetic route of topramezone
2000年, Aventis CropScience (Bayer CropScience)首次报道了磺酰草吡唑(Pyrasulfotole)[31]. 2008年, 拜耳公司在北美洲和澳大利亚同时将其推向市场, 其商品名分别是“Huskie”和“Velocity”.其作为苗后除草剂, 在25~50 g ai/ha的剂量下, 能够有效地防治常见的阔叶杂草, 如繁缕(Stellaria media)、藜属(Chenopodium album)、茄属植物(Solanum spp.)、苋属(Amaranthus spp.)和苘麻属(Abutilon theophrasti), 但对于部分的一年生禾本科杂草(狗尾草, Setaria viridis (L.) Beauv.)的防治效果并不理想.截止目前, 其还未见有交互抗性的例子报道.磺酰草吡唑是首个用于谷物田的HPPD类除草剂, 与安全剂(吡唑解草酯)制成混剂能够显著地提高作物抗药性, 使其几乎对所有品种的小麦、大麦和黑小麦表现出优异的作物安全性.磺酰草吡唑的工业化生产路线见Scheme 4, 以2-氯-4-三氟甲基苯甲酸钠盐(Ⅱ-3a)为起始原料, 经过硫甲基化、氧化、酰氯化、酯化、重排反应即可合成磺酰草吡唑.
图式4磺酰草吡唑的工业合成路线
Scheme4.Industrial synthetic route of pyrasulfotole
2016年, 青岛清原抗性杂草防治有限公司发布了2个专利化合物——环吡氟草酮[32](Pucaoke, 商品名“普草克®”)和双唑草酮[33](Xueying-TM, 商品名“雪鹰TM”) (Scheme 5), 是国内首次将HPPD抑制剂类的新化合物引入到小麦田抗性禾本科和阔叶杂草的防治上, 很好地解决了乙酰乳酸合成酶(ALS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂的抗性和多抗性问题, 尤其是环吡氟草酮是全球首次将HPPD抑制剂类化合物引入到小麦田抗性禾本科杂草的防治上.环吡氟草酮属于新型HPPD类除草剂, 可有效地防治大麦田一年生的多种单子叶和阔叶杂草, 与麦田常用的精噁唑禾草灵、炔草酯、唑啉草酯、三甲苯草酮、啶磺草胺、甲基二磺隆、氟唑磺隆、异丙隆等不存在交互抗性, 可以有效解决当年抗性及多抗性的看麦娘等禾本科杂草及部分阔叶杂草.双唑草酮对高粱田的阔叶杂草具有突出的防效, 且与当前麦田常用的双氟磺草胺、苯磺隆、苄嘧磺隆、噻吩磺隆等乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)抑制剂类除草剂, 唑草酮、乙羧氟草醚等多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)抑制剂类除草剂以及二甲四氯钠、2, 4-D等激素类除草剂不存在交互抗性, 可以有效解决抗性以及多抗性的播娘蒿、荠菜、野油菜、繁缕、牛繁缕、麦家公等阔叶杂草.
图式5双唑草酮和环吡氟草酮的工业合成路线
Scheme5.Synthetic routes of Xueying-TM and Pucaoke®
图选项
2.3 商品化吡唑类HPPD抑制剂的代谢机制
药物代谢是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律, 是药物研发产业链中的重要环节, 贯穿药物研究过程的始终.因此, 研究药物在生物体内的代谢过程和代谢产物, 对于开发新药具有重要的指导意义.目前, 已经商品化的吡唑类HPPD除草剂有7个, 从已有报道的文献来看, 对已经商品化的吡唑类除草剂, 主要研究在自然环境中的分解代谢, 而在生物体内的代谢机制和最终的代谢产物尚无明确的结论.
HPPD类除草剂从结构上来划分主要是吡唑类和三酮类.虽然吡唑环和1, 3-环已二酮互为生物电子等排体, 但是, 由于结构的差异性导致其在自然环境或生物体内的稳定性差异较大, 同时也影响植物的吸收传导.在实际应用研究中发现, 早期商品化的HPPD类除草剂苄草酯、苄草酚和吡草酮都是以前药的形式存在.其主要目的是优化原药的理化性质, 延长药物的半衰期, 提高药物利用度, 从而增强药物的活性, 降低毒副作用, 改善药物的作物安全性.
苄草唑、苄草酚和吡草酮都是用于防治水稻田中的杂草.由于其自身有一定的局限性, 例如半衰期短, 高温下对水稻具有一定的毒副作用等.早期的三类除草剂都是以前药的形式存在, 在土壤、水中缓慢水解并释放出具有生物活性的小分子Ⅱ-5a, Ⅱ-5b(Scheme 6)[34], 进而通过植物的根部吸收进入植物体内到达作用位点.由于不同种属间的差异性, 生物体内的环境不同, 其在生物体内的代谢产物也不完全相同.大部分水解生成苯甲酸类似物Ⅱ-5g, Ⅱ-5h, 苯甲酸类似物进而通过好氧降解和厌氧降解两种途径形成更为简单的代谢产物.用于玉米田中的除草剂苯吡唑草酮(Topramezone)在土壤中会被逐渐的分解代谢为羧酸衍生物Ⅱ-5c和吡唑类衍生物Ⅱ-5d和Ⅱ-5e而丧失药效[35].
图式6商品化HPPD抑制剂的代谢机制
Scheme6.Metabolic mechanism of commercialization HPPD inhibitors
2.4 经典型的吡唑类HPPD除草剂
近年来, 在商品化的除草剂基础上, 具有更高生物活性、更好作物选择性和更低使用剂量的新型HPPD抑制剂小分子不断被报道.以磺酰草吡唑为例, 都保留了分子中的苯甲酰烯醇结构, 分别对其吡唑环和芳环部分进行改造.对于吡唑环的优化主要包括两部分, 其一是对吡唑环上取代基的优化.从已经报道的HPPD晶体结构分析(图 1), 抑制剂分子中的烯醇结构与在催化活性空腔中的Fe2+形成双齿螯合作用, 吡唑环处于一个较小的疏水腔, 因此在吡唑环上引入过大或过多的取代基不利于提高其生物活性.其次是对吡唑环上羟基进行保护形成前药.前药在一定的程度上可以改善药物小分子在生物体内的吸收传导代谢, 从而提高抑制剂小分子对作物的选择性和安全性.如商品化的HPPD类除草剂苄草唑、苄草酚和吡草酮. 1999年日本石原产业株式会社报道的化合物Ⅲ-1a, Ⅲ-1b(图 4), 在63 g/ha的剂量下化合物Ⅲ-1b的除草活性明显优于化合物Ⅲ-1a, 因此对于吡唑环的修饰改造多集中于对羟基的保护.
图4吡唑类HPPD抑制剂小分子
Figure4.Pyrazol inhibitors of HPPD
报道最多的是对磺酰草吡唑芳环部分衍生物的合成.对取代芳环的研究, 2004年, 日本专利报道了一系列取代的二苯醚或二苯硫醚化合物, 在100 g/ha剂量下对部分杂草仍可达90%以上. 2006年德国巴斯夫股份公司(BASF)报道的苞卫(Topramezone, Ⅲ-2a)是目前应用于玉米田最为安全、高效的HPPD类除草剂, 具有较宽的杀草谱.尤其是对于一年生的禾本科杂草(狗尾草)和阔叶杂草(马齿苋), 具有非常好的防效.对于取代芳杂环的研究也是近年来的一个热点, 不断有新型的结构被报道出来. 2005年, 日本日产化学公司报道一类含有五元吡唑环结构的吡唑类化合物Ⅲ-3a, 所得到的大部分化合物均表现出了优良的除草效果. 2012年日本株式会社报道的吡啶酮类化合物Ⅲ-4a在1000 g/ha的剂量下对于部分杂草的防效达到100%.在2013年, KUMIAI公司又报道了含有嘧啶二酮结构[36]的化合物Ⅲ-4b, 所合成化合物同样也表现出了优良的除草活性. 2014年报道了含有三嗪酮结构化合物Ⅲ-4c, 该类化合物同样也表现出了广谱高效的除草效果.
苯并杂环的研究多集中在苯并五元环和苯并六元环的结构. 2001年, 德国巴斯夫股份公司的专利中包含一系列喹啉化合物Ⅲ-5b, 吡唑羰基部分在苯环的2, 3, 4, 5-位变换, 得到一系列类似物, 该系列衍生物在63~125 g/ha剂量下对杂草具有很好的抑制活性. 2014年我们课题组[37~39]报道的喹唑啉酮类的化合物Ⅲ-5a具有较好的作物选择性, 随后2015年他们[40]报道苯并咪唑类化合物Ⅲ-5c, 在处理剂量150 g/ha条件下, 部分化合物对苘麻、反枝苋、鳢肠、马唐、稗草的抑制活性达80%以上.在75 g/ha的剂量下, 对玉米、水稻和小麦表现出优良的作物安全性.
2.5 非经典型的吡唑类HPPD除草剂
近年来, 突破经典型HPPD抑制剂的分子结构模式, 在保留与Fe2+形成螯合作用的苯甲酰烯醇结构的基础上, 以生物电子等排原理为基础, 基于计算机辅助的药物碎片离子虚拟筛选的途径, 并结合活性亚结构拼接的方法, 对其吡唑环进行整体修饰改造. 2015年, 徐效华课题组[41]报道了一系列新型抑制剂小分子(图 5), 化合物Ⅳ-d在187.5 g/ha下, 对稗草具有一定的防效. 2009年, Matthias[42]根据电子等排原理设计合成了一类新型的铁螯合HPPD抑制剂, 如图 5所示的化合物Ⅳ-e, 在温室盆栽条件下却几乎没有除草活性.有趣的是这类化合物在酶水平上表现出了很好的抑制活性, 抑制常数IC50达到了36 nmol•L－1, 比对照药剂苞卫高出了近5倍.
图5非经典型HPPD抑制剂小分子
Figure5.Nonclassic inhibitors of HPPD
2015年, 李正名教授课题组[43, 44]报道含吡唑环类衍生物Ⅳ-f, 部分化合物在1500 g/ha的剂量下对芸苔属植物(Brassica campestris)和反枝苋类植物(Amaranthus retroflexus)分别达到40.0%和22.1%的抑制效果.同时在苗前用药, 能够抑制对苋类植物的茎叶生长, 为后续开发新型HPPD类抑制剂具有重要的指导意义.
3 总结与展望
随着现代农药的大量不合理使用, 杂草的抗性问题越来越严重.为了克服这一现状, 寻找新的作用靶标和在现有的作用机制基础上开发更为高效的抑制剂小分子或具有反抗性的抑制剂小分子, 是现在农药发展的两个重要方向.以HPPD为靶标的除草剂具有高效、低毒, 作物安全性高及环境相容性好等优势.作为竞争性作用靶标, HPPD催化中心的Fe2+位于蛋白的C-末端区域处在一个较大的溶剂空腔结构中, 与相邻的两个组氨酸和一个谷氨酸形成配位键, 抑制剂分子中的苯甲酰烯醇部分的2个氧原子能够与HPPD催化中心的Fe2+行成双齿螯合的配位作用, 形成类似一个扭曲的三角双锥体结构.其次抑制剂分子中的苯甲酰烯醇片段的芳环与相邻的两个苯丙氨酸形成三明治型的π-π堆积作用, 这一点基本上是所有HPPD抑制剂所共有的特性.从靶标的三维结构、不同种属HPPD的差异性以及HPPD与抑制剂的相互作用机制等角度分析, HPPD活性位点的氨基酸残基具有高度保守型特点, 这将为后续HPPD类抑制剂分子的设计提供了理论基础, HPPD也将是未来除草剂开发的重要作用靶标。
来源：前沿除草剂应用及耐抗性杂草防治