农药抗药性监测协助精准用药是害虫抗药性治理的一个重要环节。然而，目前针对田间小型昆虫抗药性快速可视化监测技术是缺乏的。2024年8月22日，中国农业大学昆虫毒理实验室的梁沛教授和张雷副教授课题组在Science of The Total Environment期刊上发表了题为“A tiny sample rapid visual detection technology for imidacloprid resistance in Aphis gossypiiby CRISPR/Cas12a”的研究论文。该研究以棉蚜为靶标害虫，以吡虫啉靶标烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基上的V62I和R81T抗性突变基因为研究对象，建立了基于CRISPR / Cas12a的棉蚜nAChR V62I和R81T突变的快速可视化检测技术，实现了检测过程仅需一个37℃的容器和一个440-460 nm的便携式蓝光灯，且监测结果更加直观的棉蚜吡虫啉靶标抗性的快速可视化检测技术。
该研究中建立的可用于棉蚜吡虫啉靶标抗性突变位点V62I和R81T的RPA-CRISPR方法，经过CRISPR体系的优化，10 μM / 2μM / 10 μM的ss DNA / Cas12a / cr RNA比例被选作CRISPR反应的最佳剂量，在该比例下确保了Cas12a只能准确识别与吡虫啉敏感棉蚜只有单碱基差异的抗性模板。借助Cas12a的反式切割活性，确保只有对吡虫啉有抗性的棉蚜发出肉眼可见的绿色荧光。该技术可在440 - 460 nm便携式蓝光灯照射下，在1 h内实现V62I和R81T靶标突变基因结果的可视化检测，不仅节省了抗性监测到抗性治理所需要的时间，抗性结果的直观性也减少了抗性数据获取过程中的误差。该技术的反应过程不需要任何特殊仪器，只需要37℃的热源、反应管、蓝光手电筒和反应试剂，为该技术未来能在田间现场应用提供了很大的可能性。该研究通过检测不同数量的棉蚜V62I和R81T位点基因型的结果表明，仅单个蚜虫的DNA足以检测V62I和R81T靶位抗性突变，然而作为微小昆虫的典型代表，棉蚜的体型仅为1-2毫米，这表明RPA-CRISPR方法在田间样本中快速检测抗性的高灵敏度和对小型昆虫靶位抗性监测的实用性。此外，该研究还用RPA-CRISPR方法对两个田间高抗和敏感种群的棉蚜进行了V62I和R81T基因型的检测用来反映棉蚜种群对吡虫啉的抗性，其对这两个种群基因型的检测结果与PCR测序结果相同，所反映的种群对吡虫啉的抗性结果也与生测结果一致，但RPA-CRISPR检测过程仅需一个37℃的容器和一个440-460 nm的便携式蓝光灯，且监测结果更加直观。总的来说，该研究成功建立了基于CRISPR / Cas12a的快速鉴定棉蚜对吡虫啉靶标抗性的分子生物学检测新方法，该方法可在1 h内通过肉眼有效区分n AChR β 1亚基上V62I和R81T突变的抗药表型与敏感表型。这项研究是RPA-CRISPR可视化检测技术在杀虫剂抗性监测领域的首次应用，为棉蚜及其他小型昆虫的抗药性监测提供了新的方法，为延缓棉蚜对吡虫啉的抗性发展提供帮助，有助于提高化学防治的可持续性，也为其他害虫对其他杀虫剂的抗性治理提供了理论指导。中国农业大学植物保护学院2023级硕士研究生康茹晶为论文的第一作者，中国农大植物保护学院张雷副教授为论文的通讯作者。中国农大植保学院昆虫毒理实验室的博士李仁、硕士研究生Juma Mjengi、Zohair Abbas以及农业农村部植物检疫性有害生物监测防控重点实验室硕士研究生宋一泓为论文的共同作者。本研究工作得到了国家重点研发计划（2022YFD1400300）和国家自然科学基金（32272581）等项目的支持。