一种新农药活性成分的开发要经历长达10年的时间, 平均耗资近2.5亿美金, 大多数企业不具备开发的人力和财力;世界各国的法律法规对农药登记的要求日趋严格, 不仅限于农药的残留, 施药的过程要求更加环保。新的农药活性成分上市速度从八九十年代高峰约15个/a, 逐渐降低到目前8～9个/a, 开发具有创新作用机理的农药更加困难。
SDHIs杀菌剂近几年相继开发成功, 并在主要作物市场得到推广, 市场份额年增速高达30%, 对杀菌剂市场影响深远。笔者以SDHIs杀菌剂中的吡唑萘菌胺为例, 简要分析新药开发需要考虑的明确的作用机理、理化性质、合成成本、抗性管理等方面因素, 为农药的研发起到抛砖引玉的作用。
1. SDHIs的作用机理
三羧酸循环 (TCA) 是克雷布斯博士发现并于1953年获得诺贝尔生理学和医学奖, 真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是TCA的场所, 也是呼吸作用中重要发生场所。琥珀酸脱氢酶 (SDH, 又称复合体II) 是参与TCA的一个重要环节, TCA总共有10步反应, 而琥珀酸脱氢酶参与到第7步反应之中, 加快琥珀酸的氧化成马来酸。
SDHIs杀菌剂是通过病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体II (即琥珀酸脱氢酶或琥珀酸-泛醌还原酶) 发生作用。它通过作用于蛋白复合体II影响病原菌的呼吸链电子传递系统, 阻碍其能量的代谢, 从而控制线粒体的代谢, 抑制病原菌的生长、导致其死亡, 大大降低ATP的能量储藏, 起到杀菌作用;同时SDHI也会产生活性氧类 (ROS) , 具有杀菌的能力。
2. SDHIs杀菌剂发展历史
自第一个SDHIs杀菌剂产品萎锈灵开发推出市场已经有近50年历史。萎锈灵是最初发现具有生物活性新型结构的化合物, 即先导化合物。先导化学物的发现的主要方法归纳为:随机筛选、天然产物、化学文献、组合化学、生物合理设计或结构为基础的分子设计等。
萎锈灵就是根据酰亚胺结构 (R-CO-NR'R'') 为基础的分子设计而开发的化合物。酰亚胺类化合物对担子菌纲有效, 酰亚胺类化合物与水杨酸苯胺结构相似, 水杨酸苯胺自1930年就开始用于土豆、纺织品, 防治黄枝孢霉的保护材料。由于萎锈灵是第一个系统用于种子处理的杀菌剂, 不仅用于小麦叶面黑穗病、锈病的防治, 而且可以穿透种子胚胎起到预防的作用, 此外萎锈灵对作物安全, 特别是棉花和油菜。该类产品还能刺激植物生长, 由于其新颖的作用机理, 萎锈灵的开发具有里程碑的作用。
萎锈灵作为第一个SDHIs杀菌剂被开发之后, 一系列产品经过对先导化合物结构的改造和修饰, 其药效不断得到优化。“生物电子等排取代”是对先导化合物进行合理优化的有效策略之一, 利用生物电子等排体原理取代先导化合物中的某些结构单元, 以提高其活性及选择性, 并降低毒性等。
如SDHI类杀菌剂的开发脉络 (图1) , 从1966年的萎锈灵到80年代含3氟甲基基团的氟酰胺和噻呋酰胺, 巴斯夫80年代开发了麦锈灵, 产品可用于小麦、大麦。经过不断创新, 巴斯夫于2003年开发了啶酰菌胺 (可用于子囊菌) 。啶酰菌胺的发明填补了巴斯夫灰霉病的空白, 产品包含了其他的靶标, 如交链孢霉和核盘菌属病菌, 应用拓展用于油菜籽, 水果蔬菜等经济作物。啶酰菌胺的发明和市场推广引发后来SDHIs杀菌剂的研发热潮, 其他的研发机构和公司开发并且正在不断推出多个商业化SDHIs杀菌剂产品。
3. 吡唑萘菌胺的研发案例
一个化合物的开发首先要设定明确的研发目标, 先正达开始研发SDHI类化合物时, “首要目标设定为靶标含小麦壳针孢病菌的化合物, 其次为开发具有广谱效果且用于种子处理的化合物。”目标设定后, 其研发人员对巴斯夫和孟山都的专利进行了分析, 发现在专利之外有很多的空间, 吡咯酰胺基团的化合物具有广谱效果, 且在温室的活性测试良好, 但在田间测试中证明吡咯酰胺化合物的活性不如吡唑酰胺的化合物。吡唑萘菌胺成为先正达开发的一个重要的含吡唑环的SDHI类杀菌剂。
“呋吡菌胺 (1) 用途较窄 (水稻纹枯病) , 但理化性质, 水溶性, 内吸传导性较好。我们首先选择了呋吡菌胺作为分子优化的开始。”“类似呋吡菌胺 (1) 的分子结构由于双环结构的9位上杂原子X的存在 (2) , 该活性成分对小麦壳针孢叶枯病菌的杀菌作用很低, 且总体的杀菌效果较低, 通过引入氨基苯并降冰片烯代替9位的杂原子X, 分子的活性明显, 且达到广谱效果的目标。”“通过9位的苯并降冰片烯的异丙基团和吡唑萘菌胺 (4) 中的3-二氟甲基-1-甲基-4-羧酸的共同作用可以达到防止锈病和小麦壳针孢叶枯病菌的良好效果。”
研发团队对该化合物的生物活性进行测试, 评估该产品在作物和靶标上的效果, 在温室和田间进行上千次的实验, 获得产品的安全和药效的数据, 数据在支持登记的同时也用来制定后期市场推广的策略。
图2 吡唑萘菌胺的结构优化过程
由于该化合物的构象 (图3) , 吡唑萘菌胺的吡唑基团与线粒体膜之间的琥珀酸脱氢酶紧密嵌套在一起, 而另一基团能够与叶面的表皮蜡质层结合, 有效地抗雨水冲刷, 药效更为持久。该药物能够阻止病菌的能量再生, 达到杀菌作用。
图3 吡唑萘菌胺的双结合技术
图1 SDHI类杀菌剂开发脉络
4. SDHIs杀菌剂开发的物化因素
在新的吡唑类SDHIs杀菌剂被开发合成之后, 需要进行活体或离体的实验, 来评估该杀菌剂对5种植物病原细菌 (立枯丝核菌、小麦纹枯病菌、核盘菌、玉米纹枯病菌、棉花枯萎病菌) 的生物活性;此外采用同源建模法和分子对接方法来验证目标化合物的潜在作用机理。
药物化学结构的变化影响药物与受体的结合成超分子, 其中空间位阻, 电子效用等都是影响药物与受体结合稳定性的因素。药物与受体不一定会形成一种共价键, 而是通过力结合成一种超分子, 非共价键是维持大分子结构的关键, 受体是一种大分子, 如蛋白质, 而药物的分子较小, 与受体结合而产生相应的生物活性, 药物与受体的结合能力是与同能条件下Gibbs自由能 (ΔG) 的变化有关, 主要分为三部分:亲酯性、电子效用和位阻效用。
4.1 位阻效用
空间位阻使得分子构型, 对称性, 反应活性发生变化。这主要是由于化学键的键长, 分子或原子间作用力决定的。如C-F键长和C-O键长类似, 在一个活性分子中与受体点位结合或酶-底物化合物结合就产生有相似的位阻效用, 当卤素随着其键长的增加, 其取代H后会增加与蛋白质的结合力。吡唑萘菌胺通过引入吡唑替代传统SDHIs杀菌剂的苯环、吡啶、噻吩, 其活性大幅提高, 产品用量降低。
4.2 理化性质影响
50%的现代农药和医药包含卤素, 因化合物中引入卤元素, 产生了独特的特点:代谢稳定性 (C-F取代C-H) 、碱性的变化 (膜渗透性提高, 活性提高) 、更好的亲酯性、高极性。
“杀菌剂的渗透性是一项重要指标, 当杀菌剂在叶面喷洒后, 分解并在叶面分布, 透过蜡质层, 进入表层, 并继续渗透到非原质体, 在叶肉累积, 且分散到叶面的背面, 全面的防止病菌的侵袭。”“亲酯性和水溶性是杀菌剂在叶面渗透性和分布的一项重要影响指标”。亲酯性影响农药化合物的生物活性, 由于卤素基团能够影响药物动力, 如体内吸收, 增加植物细胞壁的被动扩散, 所以具有生物活性的有效成分中含有卤素基团往往会增加其亲酯性。吡唑萘菌胺由于其理化性质, 其渗透性是一很大优势。
5. SDHIs合成的成本因素
待化合物的结构和类似结构确定之后, 需要测试产品的活性、毒理、田间试验、及其对生态环境影响, 进一步筛选具有理想活性且毒性较低的化合物。工艺合成团队同时介入研究, 确定合成该化合物的最优生产工艺, 以最低的成本进行生产, 且要求工艺创新, 合成化合物的原料易得, 避免使用有毒、有害、致敏性原料。最终实现工艺收率高、产品杂质低 (单一其他杂质根据登记法规要求含量控制在千分之一以下) , 工艺条件温和, 避免反应安全风险等。
以SDHIs杀菌剂为例, 截至目前已经开发9个吡唑酰胺类杀菌剂, 此类吡唑酰胺类杀菌剂均需要1个共同的关键中间体3-二氟甲基-1-甲基-吡唑-4-甲酸, 目前中国、印度和日本已经取得合成工艺的突破, 吡唑酰胺类SDHIs杀菌剂也会随着合成原料的不断优化, 生产和销售成本不断降低, 为SDHIs杀菌剂的市场推广带来助力。吡唑萘菌胺的合成路线筛选也充分体现了这点 (如图4) , 先正达对合成路线进行了筛选:硝基苯路线1的加氢反应用钯碳催化剂代替了价格昂贵的铑, 通过控制加氢条件, 顺反异构比例控制在85:15, 实验人员继续优化工艺, 采用路线2, 可以提高收率、减少副产物和固体残渣。
图4 吡唑萘菌胺中间体的合成路线
6. SDHIs杀菌剂的抗性与复配制剂开发
农药抗性形成的作用机理通常可以归纳为4种:1) 目标蛋白变异, 阻止杀菌剂的结合 (目标点位抗性) ;2) 蛋白质目标点位的过度表达, 增加杀菌剂的浓度;3) 外排泵将杀菌剂排出植物细胞;4) 代谢酶将杀菌剂降解。
“为了深入获得SDHI突变的情况, 2014～2015年, 通过在欧洲中部的比利时筛选和收集83棵早枯病植株和53棵苹果霉心病植株, 查看琥珀酸脱氢酶基因的不同副点位的氨基酸替代情况。植株的筛选发现突变导致对SDHI的敏感性降低。”
随着更多SDHIs杀菌剂的推出及应用范围的扩大, 世界各地相继报道SDHIs杀菌剂的抗性问题。近几年巴西农业出现比较严重的SDHIs杀菌剂的抗性问题, 杀菌剂抗性行动委员会 (FRAC) 也针对该类产品的抗性发展成立相应的SDHIs杀菌剂抗性管理小组进行统计和研究。目前在田间作物植株中发现许多种对SDHIs杀菌剂的产生抗性的病菌, 且具有较高风险的病菌主要为灰霉菌、链格孢菌、蔓枯病菌、多主棒孢菌、白粉菌等。早期的SDHIs类农药与二硫代氨基甲酸酯复配较多, 在2000年后开发的SDHIs农药大多与甲氧基丙烯酸类杀菌剂和三唑类杀菌剂复配, 以吡唑萘菌胺为例 (见表1) , 不同作用机理的杀菌剂与SDHIs杀菌剂复配, 应对抗性的发展。
表1 SDHI类杀菌剂吡唑萘菌胺的复配方案
7. SDHIs的生命周期
在专利期过后一些市场准入门槛低的市场, 原创公司产品市场份额的下降不可避免, 但在一些中高端市场, 特别是在一些市场比较规范的发达国家, 由于高昂的产品登记成本, 仿制产品的进入需要较长的一段时间。新产品的开发成为原创公司一种重要和普遍的市场保护手段, 专利后产品通过与原创专利期产品的复配, 通常为不同作用机理的产品复配, 既可以延缓产品的抗性问题, 又可以维持后专利期产品的市场份额。
如图5实线走势图, 在产品过专利期之后, 如不采用与新专利产品复配的市场防御策略, 仿制产品很容易以其低价获得市场份额, 原创企业产品的市场份额会大幅下降, 利润会大幅降低;如在产品即将过专利期时, 通过将新老产品的复配可以有效的保护过专利期的产品市场份额和利润率, 因为产品登记的门槛很高, 高端客户对价格的可接受程度, 性价比等原因, 中高端的客户会率先接受新产品, 中高端的市场份额不会大幅下降。复配方案的选择构成对过专利期产品市场份额的有效保护。
图5 定性模拟产品的生命周期走势 (对比与专利产品复配的生命周期)
8. 总结和展望
一个农药化合物的开发是一个复杂而又长期的过程, 从化合物的筛选、发现、评价、生产、剂型开发需要既考虑技术的因素, 又要考虑经济的因素。
SDHIs杀菌剂的优化只是整个农药市场研发很小的部分, 研发机构需要利用计算机模拟产品的生物活性、毒理、环境安全性, 需要通过现代的方法, 通过各种软件模拟来降低产品登记所面临的风险。研发机构还需要与市场紧密结合, 分析并找到现有产品组合的瓶颈, 通过产品的分子优化提高活性, 增加广谱性能;产品的合成工艺需要进行筛选, 不断优化, 减少三废, 降低成本。在前期温室和田间试验阶段采集的数据, 需要为后期的市场推广积累素材, 筛选并制定最佳市场方案;企业在产品的复配方面, 需要考虑自身产品组合与其它复配产品的优势, 根据法律法规的要求, 选择合适的复配产品, 快速占领市场, 延长产品生命周期。
希望SDHIs杀菌剂产品优化的案例分析会对国内生产企业有所启发和借鉴, 也期待会有越来越多新的农药产品在中国的研发企业里产生。
来源：《精细化工中间体》