当前，过表达、RNA干扰介导的基因沉默及CRISPR-Cas9等基因操作技术已广泛应用于植物病原卵菌基因功能研究。然而，针对疫霉菌中调控生长发育的关键基因或致死性基因，仍缺乏有效的遗传操作手段。因此，开发适用于疫霉菌的基因诱导表达体系，对推动卵菌功能基因组学研究具有重要意义。基于上述背景，刘西莉教授课题组在大豆疫霉中成功构建了基于四环素诱导系统（Tet-On）与CRISPR-Cas9技术相结合的Tet-On/CRISPR-Cas9诱导表达体系。相关研究结果以“The tetracycline-inducible/CRISPR-Cas9 system is an efficient tool for studying gene function in Phytophthora sojae”为题发表在Molecular Plant Pathology期刊。该诱导表达体系为大豆疫霉的关键功能基因研究提供了一种有效的方法选择。

本研究构建Tet-On/CRISPR-Cas9诱导表达体系主要步骤和原理：首先使用Promoter 2.0在线生物信息学工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/Promoter-2.0/）对目标基因启动子区域进行了预测。四环素响应启动子（Ptet）包含以下元件：来自莴苣盘梗霉的ham34基因启动子和终止子（用于表达rtTA）、七个连续TetO序列，以及含有PiPks1基因推定转录因子结合位点的最小启动子（Pmin）。目的基因启动子的上游1000 bp和下游1000 bp区域作为同源臂。利用CRISPR-Cas9体系，将目标基因的启动子替换为四环素响应启动子（Ptet）。在转化子中，目标基因在诱导剂多西环素存在时被诱导表达，在多西环素缺失时被抑制表达。

图1 大豆疫霉Tet-On/CRISPR-Cas9体系相关载体构建示意图

利用Tet-On/CRISPR-Cas9诱导表达体系，本研究获得了PsAF5和PsCesA3的诱导表达转化子。在没有多西环素存在时，PsAF5诱导表达转化子的表型与PsAF5敲除转化子ΔPsAF5-2的表型一致，具体表现为卵孢子产量增加以及对H2O2的敏感性增强。PsCesA3诱导表达转化子在没有多西环素存在时无法生长，表明PsCesA3是大豆疫霉的必需蛋白，并且PsCesA3诱导表达转化子对烯酰吗啉的敏感性增加进一步证实了CesA3蛋白是CAA杀菌剂的靶标蛋白。

图2 大豆疫霉PsAF5和PsCesA3诱导表达转化子的生物学性状