研究概述
新烟碱类杀虫剂抗药性的进化对全球农业构成威胁。为阐明其分子机制，本研究以黑腹果蝇为模型系统，探究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）β1亚基的抗性相关突变。通过CRISPR/Cas9介导的等位基因替换，我们构建了无明显适应性代价的纯合敲入突变体（V62I、V101I、R81E和A60T,R81E）。毒性生物测定显示这些突变产生不同程度的抗性，其中R81E突变对噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺的抗性倍数超过225倍。基于人工智能蛋白质-配体预测系统（Chai-1）构建的α1β1异五聚体nAChR模型表明，吡虫啉结合于正构位点，R81在此形成关键静电相互作用。距离结合位点较远的A60、V62和V101等残基，其空间距离与抗性倍数呈相关性。这些发现为理解新烟碱类抗性机制提供了遗传与结构层面的见解，为新一代杀虫剂设计和抗性治理策略奠定了基础。
研究结果
nAChR β1突变体的构建
CRISPR/Cas9基因组编辑构建nAChR β1突变体。（A）采用两阶段CRISPR介导的等位基因替换策略构建果蝇nAChR β1点突变品系示意图。（B）nAChR β1敲入品系的杂交方案。通过眼部红色荧光缺失筛选同源定向修复（HDR）事件并经PCR验证，利用眼部绿色荧光缺失去除vas-Cas9（3XP3 GFP）标记。（C,D）野生型与点突变果蝇的序列比对，替换核苷酸以红框与黑框标示。
nAChR β1突变体对新烟碱类杀虫剂产生抗性
四种果蝇nAChR β1突变体对新烟碱类杀虫剂的抗性表型。突变体与对照组雌成虫暴露于梯度浓度杀虫剂48小时后的死亡率，误差棒表示标准差。
R81E突变导致广谱抗性且无适应性代价
R81E突变体对多种杀虫剂表现交叉抗性。
R81E突变体无适应性缺陷。（A）10只果蝇24小时产卵量，均值±标准误（SEM），n=15（每组10只）。（B）二龄幼虫在常规饲料中培养7天的化蛹率，均值±SEM，n=7（每组50只）。（C）二龄幼虫培养14天的羽化率，均值±SEM，n=7（每组50只）。（D）果蝇摄食10%蔗糖3小时后的攀爬指数（5秒间隔测定），均值±SEM，n=5（每组10只）。（E）每日交配活动量，采用单因素方差分析（ANOVA）与Bonferroni校正，均值±SEM，n=20。（F）果蝇30分钟内穿越中线次数统计，均值±SEM，n=32。（G）38℃环境下30分钟内保持清醒的果蝇比例，均值±SEM，n=5（每组10只雌蝇）。（H）18℃环境下30分钟内保持清醒的果蝇比例，均值±SEM，n=5（每组10只雌蝇）。
吡虫啉与α1β1 nAChR模型的相互作用
Chai-1预测的吡虫啉与果蝇α1β1（2α:3β）nAChR模型对接模式。（A）侧视与（B）俯视五聚体通道，α1亚基呈蓝色，β1亚基呈橙色。白色箭头指示跨膜区，黄色箭头指向胞外区亚基界面结合的吡虫啉。（C,D）结合口袋特写，标注本研究涉及的关键残基。