研究概述
新烟碱类杀虫剂抗药性的进化对全球农业构成威胁。为阐明其分子机制,本研究以黑腹果蝇为模型系统,探究烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)β1亚基的抗性相关突变。通过CRISPR/Cas9介导的等位基因替换,我们构建了无明显适应性代价的纯合敲入突变体(V62I、V101I、R81E和A60T,R81E)。毒性生物测定显示这些突变产生不同程度的抗性,其中R81E突变对噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺的抗性倍数超过225倍。基于人工智能蛋白质-配体预测系统(Chai-1)构建的α1β1异五聚体nAChR模型表明,吡虫啉结合于正构位点,R81在此形成关键静电相互作用。距离结合位点较远的A60、V62和V101等残基,其空间距离与抗性倍数呈相关性。这些发现为理解新烟碱类抗性机制提供了遗传与结构层面的见解,为新一代杀虫剂设计和抗性治理策略奠定了基础。
研究结果
nAChR β1突变体的构建

CRISPR/Cas9基因组编辑构建nAChR β1突变体。(A)采用两阶段CRISPR介导的等位基因替换策略构建果蝇nAChR β1点突变品系示意图。(B)nAChR β1敲入品系的杂交方案。通过眼部红色荧光缺失筛选同源定向修复(HDR)事件并经PCR验证,利用眼部绿色荧光缺失去除vas-Cas9(3XP3 GFP)标记。(C,D)野生型与点突变果蝇的序列比对,替换核苷酸以红框与黑框标示。
nAChR β1突变体对新烟碱类杀虫剂产生抗性

四种果蝇nAChR β1突变体对新烟碱类杀虫剂的抗性表型。突变体与对照组雌成虫暴露于梯度浓度杀虫剂48小时后的死亡率,误差棒表示标准差。
R81E突变导致广谱抗性且无适应性代价

R81E突变体对多种杀虫剂表现交叉抗性。

R81E突变体无适应性缺陷。(A)10只果蝇24小时产卵量,均值±标准误(SEM),n=15(每组10只)。(B)二龄幼虫在常规饲料中培养7天的化蛹率,均值±SEM,n=7(每组50只)。(C)二龄幼虫培养14天的羽化率,均值±SEM,n=7(每组50只)。(D)果蝇摄食10%蔗糖3小时后的攀爬指数(5秒间隔测定),均值±SEM,n=5(每组10只)。(E)每日交配活动量,采用单因素方差分析(ANOVA)与Bonferroni校正,均值±SEM,n=20。(F)果蝇30分钟内穿越中线次数统计,均值±SEM,n=32。(G)38℃环境下30分钟内保持清醒的果蝇比例,均值±SEM,n=5(每组10只雌蝇)。(H)18℃环境下30分钟内保持清醒的果蝇比例,均值±SEM,n=5(每组10只雌蝇)。
吡虫啉与α1β1 nAChR模型的相互作用

Chai-1预测的吡虫啉与果蝇α1β1(2α:3β)nAChR模型对接模式。(A)侧视与(B)俯视五聚体通道,α1亚基呈蓝色,β1亚基呈橙色。白色箭头指示跨膜区,黄色箭头指向胞外区亚基界面结合的吡虫啉。(C,D)结合口袋特写,标注本研究涉及的关键残基。