概要
杀虫剂抗性已成为全球害虫治理面临的重大挑战。本研究探讨了昆虫肠道共生细菌如何以不同方式影响其对化学杀虫剂（有机磷类）和生物杀虫剂（苏云金杆菌）的抗性，旨在为制定战略性农药轮用方案提供新思路。研究发现，以小菜蛾（Plutella xylostella）为靶标害虫，长期暴露于毒死蜱（一种有机磷杀虫剂）会促进小菜蛾种群肠道共生菌——蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）的增殖，这一现象导致中国多地田间小菜蛾种群对毒死蜱产生抗性，且抗性水平与该细菌的丰度呈显著正相关。代谢分析表明，蒙氏肠球菌可通过肠球菌属中一种保守的细胞色素P450酶直接代谢毒死蜱。然而，在抗毒死蜱种群的肠道中，蒙氏肠球菌的积累可能会增强其对苏云金杆菌毒素的敏感性，从而使苏云金杆菌在高化学杀虫剂抗性种群中展现出更高的防治效果。苏云金杆菌造成的肠道屏障破坏，会促进蒙氏肠球菌从肠道侵入血淋巴，引发败血症导致小菜蛾死亡，进而增强其敏感性。本研究揭示了肠道共生细菌介导的化学合成杀虫剂抗性与生物杀虫剂抗性之间的相互作用，并提出了一种化学/生物农药轮用防治策略——该策略或可应用于其他化学合成杀虫剂抗性的治理场景。
研究背景
全球害虫严重威胁农业生产与粮食安全。有机磷类等化学农药是主流防治手段，但易导致环境污染和害虫抗药性；低毒的苏云金杆菌（Bt）等生物杀虫剂虽环境友好，但易被紫外线分解且成本高，二者结合仍是综合害虫管理（IPM）的重要手段。小菜蛾是全球抗药性最强的害虫，已对104种杀虫剂活性成分产生抗性。本研究以小菜蛾为研究对象，探究肠道共生菌蒙氏肠球菌对小菜蛾有机磷杀虫剂（毒死蜱）及苏云金杆菌抗性的影响，旨在揭示肠道共生菌介导的两类杀虫剂抗性关联机制，为害虫防治提供新策略。
研究结果
1.小菜蛾田间种群对毒死蜱的抗性水平在中国仍居高不下
2022-2023年在中国采集16个小菜蛾田间种群对毒死蜱的毒性数据。与敏感种群（SS）相比，12个田间种群对毒死蜱表现出高抗性（102.8-1931.2倍），其中北京种群的抗性水平最高；4个田间种群表现出中等抗性（21.0-71.9倍）。所监测的种群中均无敏感或低水平抗性种群，表明中国各地小菜蛾对毒死蜱的抗性仍处于较高水平（图1A）。
图1 毒死蜱抗性和敏感的小菜蛾种群的肠道共生细菌群落
2.蒙氏肠球菌通过P450酶代谢毒死蜱以增强小菜蛾对毒死蜱抗性
通过高通量16S rDNA扩增子测序分析表明，高抗毒死蜱的代表性田间种群肠球菌属的相对丰度显著高于敏感种群（图1B和1D）。经分离培养共检测到16种小菜蛾肠道细菌，其中一种被鉴定为蒙氏肠球菌（图2A和2B），且为唯一分离出的肠球菌物种。通过荧光原位杂交（FISH）技术定位，发现荧光信号主要集中在中肠（图2C和2D）。
图2 蒙氏肠球菌的分离定位及其与毒死蜱抗性的关系
用qPCR分析1个敏感种群和16个田间抗性种群中蒙氏肠球菌的相对丰度发现，16个田间抗性种群肠道中蒙氏肠球菌的相对丰度与它们对毒死蜱的抗性水平呈显著正相关（斯皮尔曼相关系数，r=0.8059，p<0.0001）（图2F）。
高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析显示，与对照组相比，蒙氏肠球菌（WT）处理7天后可代谢约78.2%的毒死蜱（图3B）。体外代谢实验结果表明，P450基因敲除株的毒死蜱代谢效率极低（图3B），表明蒙氏肠球菌中的P450酶是参与毒死蜱代谢的关键因素。补充蒙氏肠球菌可增强小菜蛾敏感种群对毒死蜱的抗性（图4），而喂食氯霉素（CAP）去除抗性小菜蛾中的蒙氏肠球菌则显著增强了小菜蛾对毒死蜱的敏感性（图5）。
图3 蒙氏肠球菌体外代谢毒死蜱
图4 补充蒙氏肠球菌增强宿主对毒死蜱的抗性
图5 去除蒙氏肠球菌降低宿主对毒死蜱的抗性
3.抗毒死蜱种群中高丰度的蒙氏肠球菌增加苏云金杆菌毒性及其相关机制
研究发现，5个田间种群对苏云金杆菌表现出中等抗性（12.4-70.8倍），其中广西种群的抗性最高；3个田间种群表现出低抗性（5.9-8.4倍），其余8个种群对苏云金杆菌敏感（图6A）。斯皮尔曼相关分析显示，16个田间种群中蒙氏肠球菌的相对丰度与它们对苏云金杆菌的抗性水平呈负相关（r=-0.4676，p=0.0349）（图6B）。仅考虑苏云金杆菌抗性（>3倍）的田间种群，蒙氏肠球菌丰度与苏云金杆菌敏感性的相关系数（r）为-0.7455（p=0.0056），且>6倍抗性时，相关性仍然显著（r=-0.8929，p=0.0062）。
图6 蒙氏肠球菌介导小菜蛾对苏云金杆菌的抗性
生物测定结果表明，喂食蒙氏肠球菌降低小菜蛾对苏云金杆菌的抗性（图6D和6E）。小菜蛾幼虫死亡后变黑（图6G），表明可能是败血症导致小菜蛾死亡。进一步研究发现，苏云金杆菌毒素破坏小菜蛾肠道屏障后，肠道内大量蒙氏肠球菌会侵入血淋巴引发败血症（图6H）。另外，喂食CAP去除抗性种群肠道中的蒙氏肠球菌（图7A），小菜蛾对苏云金杆菌的敏感性降低（图7B-E）。
图7 去除蒙氏肠球菌增强小菜蛾对苏云金杆菌的抗性
讨论
本研究揭示了蒙氏肠球菌作为“调控枢纽”，在介导小菜蛾对毒死蜱产生抗性的同时，增强其对苏云金杆菌敏感性的分子机制。填补了肠道菌影响两类杀虫剂抗性相互作用的研究空白。鉴于肠球菌或参与多种化学农药抗性，未来可探究其对其他农药抗性的作用及机制。而基于蒙氏肠球菌的“化学-生物农药轮用”策略，为解决化学农药抗性提供新路径，能推动化学与生物杀虫剂高效联合使用，为杀虫剂抗性管理及综合害虫管理提供实践参考，具重要应用价值。
第一作者及通讯单位：李璐中国农业大学植物保护学院
杨琼澳大利亚墨尔本大学
通讯作者及通讯单位：梁沛、朱斌中国农业大学植物保护学院
Ary Hoffmann 澳大利亚墨尔本大学