申请公布号：CN110564860A

申请公布日：2019.12.13

申请号：2019105284178

申请日：2019.06.18

申请人：***

发明人：***

地址：***

分类号：C12Q1/6888(2018.01)I; C12N15/11(2006.01)I 

摘要： 本发明公开了一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因P450基因CYP4C64是否突变的PCR引物对,以及一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因P450基因CYP4C64是否突变的方法。所述引物对核苷酸序列如下：CYP4C64突变鉴定‑F：ATCGATCGGAAATTCGGGGCTGA，CYP4C64突变鉴定‑R：TTTGATGGAATTTTTTCCCGGTCATGC。烟粉虱对于新烟碱类杀虫剂噻虫嗪的抗性检测尚无特异性的突变位点，本发明通过烟粉虱抗性基因CYP4C64的5’UTR区域中的单碱基位点突变来检测田间烟粉虱对噻虫嗪的抗性水平，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对噻虫嗪抗药性快速检测提供了理论基础。

背景技术：

烟粉虱bemisiatabaci(gennadius)，是世界性的农业害虫，给生产带了极大的危害。20世纪80年代以后，陆续分布于全球除南极洲外各大洲的90余个国家和地区，且寄住植物多达74科500多种。在中国，该害虫在90年代末期成为我国重要的经济作物害虫，主要为害种类为b生物型，由于其入侵性强危害性大又被冠以“超级害虫”；q生物型烟粉虱于2003年首次由本实验室在云南地区花卉市场被发现，之后快速扩散到全国各地，目前这两种生物型烟粉虱是我国蔬菜和花卉等作物上危害最大的生物型。烟粉虱不仅直接刺吸植物汁液，造成植株衰弱、干枯，而且还传播植物病毒病。由烟粉虱作为传毒媒介而引起的危害甚至使部分地区整棚番茄绝收，给生存带来了极其严重的危害。鉴于烟粉虱直接危害和间接危害的严重性，在农业生产中烟粉虱的防治工作已经到了刻不容缓的地步。

烟粉虱主要以化学防治为主，杀虫剂的过量使用，导致烟粉虱已对各种防治用药产生了不同程度的抗性，尤其对防治烟粉虱使用最长、应用范围最广的新烟碱类杀虫剂抗药性最强。噻虫嗪是第二代全新结构的新烟碱类杀虫剂，自2000年进入中国市场后，一直是防治烟粉虱的首选。首次发现烟粉虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性是在西班牙南部的园艺生产区，后不久又在以色列和西班牙相继发现接近1000倍的烟粉虱噻虫嗪抗性种群，且高抗种群对其它烟碱类药剂存在显著交互抗性。近年来，我国的北京、江苏、浙江、新疆、湖北等全国大多数省份也陆续有烟粉虱对新烟碱类药剂产生抗性的报道，而且我国北至黑龙江、南至海南、西至青海、东到上海的大部分地区均有烟粉虱分布和危害，危害生物型主要为q型和b型，且抗药性普遍很高。因此抗药性是导致烟粉虱大爆发且难以治理的主要原因之一。

害虫抗药性治理依赖于害虫抗性机制的阐明，但目前人们对烟粉虱抗新烟碱类杀虫剂的抗性机制仍“知之甚少”。有关新烟碱类杀虫剂的作用机制，人们普遍认为，其主要作为后突触烟碱乙酰胆碱受体(nachrs)的激动剂，作用于昆虫的中枢神经系统而使昆虫抽搐麻痹死亡。因此，关于新烟碱类杀虫剂抗性机制研究一般集中在nachrs，如在桃蚜、果蝇、稻飞虱、疟蚊、以及蜜蜂等昆虫中均发现nachrs突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关。除靶标不敏感性外，昆虫对新烟碱类杀虫剂的抗性机制也和代谢机制有关，如最近在桃蚜、家蝇、褐飞虱中均发现细胞色素p450氧化酶基因介导的代谢解毒与噻虫嗪抗性有关。而在烟粉虱中，至今没有发现nachrs的突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关的报道，但是通过生化和分子生物学手段发现一种细胞色素p450基因(cyp6cm1)和吡虫啉抗性有关。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64突变位点,以及鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64是否突变的方法，烟粉虱对于新烟碱类杀虫剂噻虫嗪的抗性检测尚无特异性的突变位点，本发明通过烟粉虱抗性基因cyp4c64的5’utr区域中的单碱基位点突变来检测田间烟粉虱对噻虫嗪的抗性水平，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对噻虫嗪抗药性快速检测提供了理论基础。

因此，本发明提供如下技术方案：

一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64是否突变的pcr引物对，所述引物对核苷酸序列如下：

cyp4c64突变鉴定-f：atcgatcggaaattcggggctga

cyp4c64突变鉴定-r：tttgatggaattttttcccggtcatgc。

本发明还提供一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64是否突变的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取烟粉虱总rna；

(2)利用所述cyp4c64突变鉴定引物进行pcr；；

(3)pcr产物回收后连接转换测序鉴定；

(4)分析序列中32位a和t的比率，从而鉴别其对噻虫嗪的抗性水平。

所述的引物对或所述的方法，其中所述烟粉虱为q型烟粉虱。

同时，本发明还提供一种降低烟粉虱对噻虫嗪的抗药性的方法，该方法对烟粉虱抗性品系进行rnai干扰，降低p450基因cyp4c64的表达。

同时，本发明还提供烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64的突变位点，所述突变位点位于5’utr区域，通过突变引物测序后所得序列，检测32位a或者t的比率，通过统计该位点a的频率来检测对噻虫嗪的抗性水平，该位点在噻虫嗪抗性中主要为a碱基，而在敏感种群中主要以t碱基形式出现。

本发明具有以下有益效果：本发明通过烟粉虱抗性基因cyp4c64的5’utr区域中的单碱基位点突变来检测田间烟粉虱对噻虫嗪的抗性水平，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对噻虫嗪抗药性快速检测提供了理论基础。通过本发明的应用，科研快速检测田间烟粉虱对噻虫嗪的抗药性水平，从而为合理使用杀虫剂提供了技术支撑。

附图说明

图1cyp4c64基因在烟粉虱对噻虫嗪抗性和敏感品系中的表达量。

图2cyp4c64基因rnai后烟粉虱对噻虫嗪的抗性水平显著下降。

图3噻虫嗪抗敏品系cyp4c645’utr区域比较。

图4噻虫嗪抗敏品系cyp4c645’utr区域区域突变示意图。

具体实施方式

供试昆虫

q型烟粉虱噻虫嗪田间敏感种群(thiamethoxam-susceptibleb.tabaciqstrain，thqs)，田间噻虫嗪抗性种群thqr在室内进行反向汰选得到的相对敏感种群，在室内温室用辣椒(中椒#4；capsicumannuuml.)饲养至今，未施用任何杀虫剂。噻虫嗪抗性种群thqr于2011年采集于浙江杭州地区，室内饲养至今，一直用噻虫嗪进行汰选。另一抗噻虫嗪抗性种群nk于2018年采集于北京南口地区，采集后立即进行试验。

供试试剂

rna提取试剂trizol：购自lifetechnologiescorporation公司

race试剂盒smarttmracecdnaamplificationkit：购自clontech公司

cdna反转录试剂盒rtreagentkit(realtime)：购自日本takara公司

荧光定量pcr试剂盒superrealpremixplus(sybrgreen)：购自北京天根生化科技有限公司

dsrna合成试剂盒t7ribomaxexpressrnaisystem：购自promega公司

dna分子量标准，蛋白酶k，x-gal和iptg：购自北京天根生化科技有限公司；

苄青霉素；酵母提取物和胰蛋白胨：购自美国amresco有限公司；

pcr引物，goldview和琼脂糖：合成和购自北京擎科新业生物技术有限公司；

琼脂糖凝胶电泳缓冲液tbe配置：

浓度高的贮存液5×tbe：trisbase54.0g，硼酸27.5g，0.5m乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)20ml，用ph计精细调节ph为8.0，加ddh2o定容到1000ml；工作液为5×tbe储存液稀释10倍以后的0.5×tbe；

pcrestaq带有6×loadingbuffer的混合液：购自北京康为世纪生物科技有限公司；

top10感受态细胞；pcr产物纯化试剂盒，peasy-t1载体：购自全式金北京公司；

lb培养基配置：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入干净的蒸馏水950ml，用1.0mol/lnaoh调ph至7.0，定容到1l，115℃高压湿热灭菌20分钟，待用；

其它实验室常用化学试剂(分析纯)均为市售。

主要仪器

荧光定量pcr仪：美国abi7500；

pcr仪器：bio-rads1000和bio-radc1000；

电泳槽和水浴锅：北京六一仪器厂；

高速离心机：德国sigma3k15；

核酸电泳系统和凝胶成像系统(geldoceq)：美国bio-rad公司；

超纯水仪：zmq55votiminiq纯水仪；

分子实验用移液器：德国eppendorf公司；

超净工作台：苏州净化科技有限公司。

湿热高压灭菌锅：日本sanyo公司；

台式冷冻振荡器(thz-c-1)：太仓市实验设备厂。

实施例1：烟粉虱基因组dna，rna提取及cdna合成

烟粉虱基因组dna提取采用takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0试剂盒，步骤参考操作说明，获得的dna，-20℃保存。

采用triol方法提取烟粉虱总rna，具体步骤如下：取生活状态良好的烟粉虱成虫50头，尽量龄期一致，雌雄比例接近1:1。取完烟粉虱后立即放入液氮中冷冻，防止rna降解。将烟粉虱样品在超净台中放入1ml的180℃灭菌6h的匀浆器中，向其中加入1ml的trizol进行充分匀浆，然后小心转移至1.5ml的rna专用离心管中，室温静置5分钟。加入200μl氯仿，漩涡振荡器剧烈振荡30s，室温静置5分钟，低温离心，4℃12000rpm离心15分钟。离心完毕后小心拿出离心管，轻轻吸取400μl的上清液，不要触碰中间的蛋白质层，转移上清液到另一个干净的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上冷却10分钟后沉淀rna，然后4℃12000rpm离心10分钟，小心吸出上清液，加入1ml70％的无水乙醇进行漂洗，4℃8000rpm离心5分钟。小心吸取乙醇，超净台中吹干5分钟，加入适量预冷的depc水进行溶解，测定od260/od280的比值和含量，并且进行变性胶电泳检测rna质量。

采用takara公司的试剂盒rtreagentkit进行cdna合成。

1)基因组dna除去

向rna专用的pcr管中，小心加入5×gdnaeraserbuffer2.0μl；gdnaeraser1.0μl；totalrna1.0μg(依据提取rna浓度换算需要加的体积)；rnasefreeddh2o补充到10μl，迅速放入pcr仪中42℃，2分钟。

2)cdna合成

向已经除去dna的pcr管中加入5×primescriptbuffer24.0μl；primescriptrtenzymemix1.0μl；rtprimemix1.0μl；rnasefreeddh2o4.0μl，然后迅速放入pcr仪中，37℃，15分钟进行rna反转录，85℃5秒种使得反转录酶失活，然后-20℃保存备用(-80℃可长期保存)。

实施例2：荧光定量pcr分析

田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂噻虫嗪产生严重的抗药性，但抗性机制尚不清楚，本发明人通过前期研究发现cyp4c64基因在室内筛选的抗性种群过量表达，通过采集田间种群，并且进行荧光定量pcr分析cyp4c64基因的表达，来验证该基因是否参与田间烟粉虱的抗药性形成。采用表1中的引物2进行cyp4c64基因表达量分析，内参基因选择表1中引物2和3，通过计算相对表达量的方法确定cyp4c64基因的表达情况。应用天根公司superrealpremixplus试剂盒进行qpcr检测，反应体系和反应程序见表2，按照说明书加入各反应物，然后在abi7500上检测引物，qrt-pcr数据采用2-δδct法计算抗性和敏感品系之间基因表达量的差距。

表1cyp4c64基因荧光定量pcr引物

f，正向引物；r，反向引物

表2qrt-pcr反应体系以及反应程序

结果分析

收集田间烟粉虱样品，获得两个抗性品系，抗性倍数都达到了高抗水平，结果请见下表3。

表3

通过荧光定量pcr分析噻虫嗪抗性和敏感品系中cyp4c64基因的表达量，发现该基因在两个抗性品系中过量表达，请参见图1所示,cyp4c64基因在抗性品系中表达量显著高于敏感品系，通过比较室内饲养的q型烟粉虱抗性品系(thr)和敏感品系(ths)，发现p450基因cyp4c64在抗性品系中过量表达18倍。

实施例3：对烟粉虱抗性品系中进行rnai实验

在抗性品系中进行rnai实验。由于烟粉虱体积小，通过显微注射进行rnai会造成很高的死亡率，所以本实验采用饲喂法进行烟粉虱的rna干扰实验。

1)饲喂营养液准备

饲喂法进行rnai需要在活体植物外得到一个能维持烟粉虱正常生长的环境，通过摸索发现30％的蔗糖和5％的酵母浸出物混合形成的营养液可以在体外很好的维持烟粉虱存活。首先配制30％的蔗糖溶液和5％的酵母浸出物，充分溶解后，采用0.22μm的细菌滤器进行过滤，防止实验过程中微生物的滋生，不可进行高温高压灭菌，因为蔗糖在高温下糊化生成有毒物质，不利于烟粉虱取食。

2)实验装置

准备长度为50mm，内径为20mm的透明玻璃管，封口膜，黑色的棉塞和遮光布制作的能够覆盖上述玻璃管的管套，以及一个能够控温控湿的光照培养箱。玻璃管用于放置烟粉虱，以进行体外实验；封口膜用于在玻璃管一端制作含有营养液的饲喂小袋，以供烟粉虱取食；黑色的棉塞和管套用于创造一个黑暗的环境，只有饲喂小袋方向存在光源，利用烟粉虱的向光性使得烟粉虱迅速附着在饲喂小袋方向进行取食，如若不然烟粉虱会长期附着在玻璃管的其他位置而造成实验的均一性不好。

3)烟粉虱饲喂

首先准备好dsrna，外源对照基因dsgfp，应用烟粉虱营养液配制成实验浓度0.5μg/μl。取一小块封口膜，第一层尽量拉伸的很薄，覆盖在玻璃管一端，然后加入200μl的上述配制好的营养液，再取一小块封口膜适量拉伸后覆盖在液滴上，尽量排除气泡，制作一个双层封口膜形成的含有营养液和dsrna的小袋，以供烟粉虱取食。最后将玻璃管另一个开口端放在附有烟粉虱的叶片上，轻拍叶片使得烟粉虱飞入管内，然后小心塞上黑色棉塞，包上遮光管套。放置在培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源，培养条件为光照14：10，湿度80％(较高的湿度可以防止营养液挥发)。应用上述方法对thqr种群的烟粉虱进行cyp4c64基因的rnai实验，实验结果请参见图2，敲低该基因的表达能显著降低烟粉虱对噻虫嗪的抗药性。

实施例4：对烟粉虱cyp4c64基因序列进行比较分析

采用表1中的引物1进一步对cyp4c64基因序列进行比较分析，发现该基因5’utr区域在噻虫嗪抗性种群中存在一个较为稳定的突变位点，该位点位于cyp4c64基因5’utr区域32位点，该位点在噻虫嗪抗性中主要为a碱基，而在敏感种群中主要以t碱基形式出现，通过检测该位点的碱基形式来判断烟粉虱对噻虫嗪的抗药性水平，实验结果请参见图3和4。

技术特征：

1.一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64是否突变的pcr引物对，所述引物对核苷酸序列如下：

cyp4c64突变鉴定-f：atcgatcggaaattcggggctga

cyp4c64突变鉴定-r：tttgatggaattttttcccggtcatgc。

2.一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64是否突变的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取烟粉虱总dna；

（2）利用权利要求1所述的cyp4c64突变鉴定引物进行pcr；；

（3）pcr产物回收后连接转换测序鉴定；

（4）分析p450基因cyp4c64序列中5’utr区域32位点a和t的比率，从而鉴别其对噻虫嗪的抗性水平。

3.根据权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述32位点在噻虫嗪抗性中主要为a碱基，而在敏感种群中主要以t碱基形式出现，通过检测该位点的碱基形式来判断烟粉虱对噻虫嗪的抗药性水平。

4.根据权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述烟粉虱为q型烟粉虱。

5.一种降低烟粉虱对噻虫嗪的抗药性的方法，其特征在于：对烟粉虱抗性品系进行rnai干扰，降低p450基因cyp4c64的表达。

6.烟粉虱对噻虫嗪抗性基因p450基因cyp4c64的突变位点，所述突变位点位于5’utr区域，通过权利要求1所述的引物对测序后所得序列，检测32位a或者t的比率，通过统计该位点a的频率来检测对噻虫嗪的抗性水平。

技术总结

本发明公开了一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因P450基因CYP4C64是否突变的PCR引物对,以及一种鉴定烟粉虱对噻虫嗪抗性基因P450基因CYP4C64是否突变的方法。所述引物对核苷酸序列如下：CYP4C64突变鉴定‑F：ATCGATCGGAAATTCGGGGCTGA，CYP4C64突变鉴定‑R：TTTGATGGAATTTTTTCCCGGTCATGC。烟粉虱对于新烟碱类杀虫剂噻虫嗪的抗性检测尚无特异性的突变位点，本发明通过烟粉虱抗性基因CYP4C64的5’UTR区域中的单碱基位点突变来检测田间烟粉虱对噻虫嗪的抗性水平，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对噻虫嗪抗药性快速检测提供了理论基础。

联系方式

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