申请公布号：CN110564741A

申请公布日：2019.12.13

申请号：2019109831925

申请日：2019.10.16

申请人：***

发明人：***

地址：***

分类号：C12N15/29(2006.01)I;  

摘要： 本发明涉及农业技术领域，特别涉及基因及其抗草甘膦除草剂的应用。本发明通过根据大豆密码子的偏好性对该基因进行了适当的改造，发现改造后的MIAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，显著提高了蛋白的表达量，并且获取高耐草甘膦的有效转基因大豆事件的概率大大提高。

背景技术：

1996年，美国孟山都公司成功的研究出耐除草剂转基因大豆，耐除草剂转基因大豆在美国、阿根廷、巴西等国迅速普及，种植面积迅速扩大。而在所有转基因大豆的性状中，耐除草剂性状一直占主导地位。截至2017年5月，全球共有36个转基因大豆转化事件，其中抗除草剂转基因大豆转化事件28个，占转基因大豆转化事件的77.8％。

草甘膦具有有良好的内吸收性和低毒性，能够与土壤结合紧密，并且其结构简单，是杀草谱最广的芽后除草剂。其作用于莽草酸途径，抑制叶绿体酶5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsp)。epsps广泛存在于真菌、细菌、藻类、高等植物的叶绿体内，参与芳香族氨基酸的生物合成。在草甘膦的作用下，莽草酸途径的反馈抑制受阻，导致莽草酸的大量积累，芳香族氨基酸的合成极大的减弱，随之使得植物死亡。但是，草甘膦是一种非选择性除草剂，这个特性极大限制了它的使用时间和范围。所以，人们一直在致力于抗草甘膦作物的研究和培育工作，从20世纪80年代开始，人们开始借助于重组dna技术来开发抗草甘膦作物。抗草甘膦基因的原理和机制主要有以下三方面：一是促使epsps基因超量表达，如shah等从牵牛花中克隆出epsps基因cdna序列，构建表达载体，转入牵牛花中，使其具有草甘膦抗性。但这种抗性比较弱，并不能满足商业化要求；二是转入一个与草甘膦亲和性低的epsps基因，如bayer公司通过在玉米中表达突变的epsps基因从而获得抗草甘膦转基因玉米ga21。这类基因是用于商业化应用的主要基因。三是导入一个降解草甘膦的基因。1995年penaloza等克隆到草甘膦降解基因glpa和glpb，导入对草甘膦敏感的大肠杆菌中使之具有草甘膦降解的能力

最早的epsps基因专利是美国的calgene公司1983年1月1日在美国申请的。目前，已经产业化的抗草甘膦转基因作物几乎全部为转农杆菌基因，cp4epsps基因是孟山都公司克隆的并在1994年申请了相关专利(专利号：us5633435)，2014年过期。am79-epsps基因编码的蛋白属于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，epsps)，氨基酸序列与报道的agrobacteriumspepsps酶的氨基酸序列同源性仅为22％，两者差异性显著。该基因专利“高耐受草甘膦的epsps合酶及其编码序列”。am79-epsps蛋白与应用广泛的cp4epsps蛋白同属于epsps家族类蛋白。

植物中的内源epsps基因编码的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸转移酶(epsps)是植物体内芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)生物合成途径中的一个关键酶，而这些芳香族氨基酸都是构建细胞蛋白最基本的氨基酸。在这一生物合成途径中，epsps酶催化莽草酸-3-磷酸转变为3-烯醇式丙酮酸莽草酸-5-磷酸。除草剂草甘膦可以抑制植物内源epsps的活性，从而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致细胞死亡。来自于土壤的am79-epsps基因编码产生的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(am79-epsps)蛋白与植物内源性epsps蛋白相比，对草甘膦的亲合力大大降低，在草甘膦存在的条件下保证了植物对芳香氨基酸的合成。

将现有的am79epsps基因直接导入大豆，能够筛选出其在大豆中表达量高转化体的概率低，转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率低。因此，提供一种改造后的基因，使得筛选出高表达量转化体的概率和转化体能耐受高倍(4倍以上)草甘膦的概率大大提高，具有重要的现实意义。

技术特征：

1.基因，其特征在于，具有：

(ⅰ)如seqidno.2所示的核苷酸序列；或

(ⅱ)如seqidno.2所示的核苷酸序列的互补序列；或

(ⅲ)与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或

(ⅳ)具有seqidno:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与seqidno.2所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述多个核苷酸序列为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个。

3.一种含有如权利要求1或2所述基因的重组dna。

4.一种表达载体，其特征在于，插入如权利要求3所述的重组dna，并以微生物、动物细胞或植物细胞作为宿主细胞。

5.一种由如权利要求4所述的表达载体转化的转化子。

6.如权利要求1或2所述基因抗草甘膦除草剂的应用。

7.如权利要求1或2所述基因增强大豆对草甘膦除草剂抗性的应用。

8.如权利要求1或2所述基因在提高蛋白表达量中的应用。

9.获得抗草甘膦除草剂的大豆的方法，其特征在于，将如权利要求1或2所述基因转入大豆植株，筛选。

10.一种检测转如权利要求1或2所述基因的大豆的引物组或试剂盒，包括能够扩增如权利要求1或2所述基因的引物，所述引物如seqidno.3和seqidno.4所示。

技术总结

本发明涉及农业技术领域，特别涉及基因及其抗草甘膦除草剂的应用。本发明通过根据大豆密码子的偏好性对该基因进行了适当的改造，发现改造后的MIAM79 EPSPS基因更适合在大豆中表达，显著提高了蛋白的表达量，并且获取高耐草甘膦的有效转基因大豆事件的概率大大提高。

有关此专利详情请联系农药知识产权运营交易中心； 联系人：史先生；联系电话：0513-89093796。