申请公布号：CN109666675A
申请公布日：2019.04.23
申请号：2018113881316
申请日：2018.11.21
申请人：******
发明人：***;
地址：310018浙江省杭州市下沙高教园区学源街258号
分类号：C12N15/12(2006.01)I;
C07K14/435(2006.01)I; C12N15/87(2006.01)I; A01K67/033(2006.01)I
摘要： 本发明公开了一种褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用。NlAtg3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因是褐飞虱正常生存所必需，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。NlAtg3基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的NlAtg3基因或蛋白的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。本发明对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的存活率下降，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。
背景技术：
水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。同时，由于水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，其转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。
粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。但近几十年来水稻受到大面积的病虫为害，使水稻生产受到威胁。褐飞虱是我国水稻生产中的主要害虫，其成虫和若虫以口针刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，导致减产或绝收。据中国农业年鉴记载，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，褐飞虱危害面积达到水稻总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。目前我国每年水稻褐飞虱发生面积为2000万公顷以上，每年因褐飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。褐飞虱已对我国水稻生产安全形成严重威胁。
目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国当前粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。事实上由于化学杀虫剂的连年大量施用，褐飞虱抗药性成倍增加，使药剂防治的效果有限。同时使用化学杀虫剂防治褐飞虱，一方面增加了农民的生产成本，另一方面化学杀虫剂还造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食污染等环境和生态问题。
利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。国际水稻研究所(IRRI)的研究结果和东南亚的水稻生产实践证明，即使是只有中等抗性水平的水稻品种，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成实际的危害和产量损失。因此，挖掘水稻抗褐飞虱基因并在水稻育种项目中应用是防治水稻褐飞虱的根本措施。
水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已经在普通栽培稻和野生稻资源中鉴定和定位了二十多个水稻抗褐飞虱的主效抗虫基因(具体综述见Jena等，2010.Current status of Brown Planthopper(BPH)resistance and genetics.Rice 2010(3),161-171)。其中，Bph14基因已经成功克隆，这是国际上首次利用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因(Du et al 2009)。
图位克隆(map-based cloning)又称为定位克隆(positional cloning)，是随着分子标记遗传连锁图谱的发展而发展起来的一种基因克隆技术。图位克隆法步骤包括对目标基因进行遗传定位、物理定位、序列分析及遗传转化验证功能。从理论上讲，任何一个能定位的基因都可用图位克隆法分离。图位克隆法一般适合于基因组比较小的物种，如单子叶模式植物水稻，具有基因组小、基因组物理距离与遗传距离之比小而且标记丰富的特点，是最适合应用图位克隆法分离目的基因的作物之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种水稻抗褐飞虱的基因Bph30及其应用。
本发明采用遗传学的方法，构建水稻抗褐飞虱的分离群体，利用图位克隆的方法，分离到水稻抗褐飞虱基因Bph30。通过共分离标记检测表明该基因与抗褐飞虱性能是共分离的，通过遗传转化Bph30基因，使感性水稻出现抗褐飞虱的表型，证实了该基因的功能。
本发明提供水稻抗褐飞虱基因Bph30，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长9477bp，具有3个内含子和4个外显子，第一个外显子区段为2603-2774，第二个外显子区段为3344-3616第三个外显子区段为4427-7651第四个外显子区段为7853-8586，cDNA全长4404bp。
进一步地，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码1082个氨基酸。
本发明还提供了所述基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
应当理解，在不影响BPH30蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
本发明包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
本发明还提供了所述基因在水稻选育中的应用，所述水稻选育为提高水稻对褐飞虱的抗性。
本发明还提供了与水稻抗褐飞虱基因Bph30紧密连锁的分子标记，所述分子标记为S7；
用于扩增分子标记S7的引物对如下：
正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG
反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT
本发明还提供了所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。
本发明还提供了水稻抗褐飞虱基因Bph30的分子检测方法，通过所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段，则标志着水稻抗褐飞虱基因Bph30的存在。
本发明还提供了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，通过所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段,则标志着水稻品种褐飞虱抗性的存在。
本发明提供一种培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括：
1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飞虱Bph30基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
2)将被转化的植物细胞再生为植物；
3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到表达。
本发明还提供一种产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因Bph30的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植物。
其中所述植物是单子叶植物。
优选地，所述植物是水稻。
本领域技术人员应能理解，根据本发明公开的序列来设计或产生分子标记可用于抗褐飞虱水稻的选育工作。
本发明通过如下步骤克隆得到Bph30基因：
1.Bph30基因精细定位。根据国际水稻基因组计划公布的水稻基因组序列，设计第4染色体Bph30所在目标区段的SSR标记和InDel标记的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测标记在BC2F2大群体中的分离，通过筛选得到的重组单株的表型与基因型的关系，将抗褐飞虱基因Bph30定位在分子标记SSR-28和SSR-69之间，与分子标记S7紧密连锁。
2.候选基因确定。通过PCR方法分段扩增含抗褐飞虱基因Bph30的抗性亲本水稻材料(AC1613)的基因组DNA并拼接得到Bph30所在区段的基因组序列，应用FGENESH在线预测基因，并通过与日本晴序列作对比分析，确定Bph30的候选基因。
3.全长cDNA克隆。根据预测的cDNA序列设计引物，从抗褐飞虱水稻的cDNA中扩得500bp片段，以该段序列设计引物，通过RACE(cDNA末端快速扩增技术)得到了cDNA的3’端和5’端序列，最终获得Bph30的全长cDNA。
然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的Bph30的核苷酸序列，通过设计恰当的PCR引物，即可从抗褐飞虱水稻基因组中扩增得到Bph30基因。
4.遗传转化Bph30基因验证其功能。根据Bph30基因的ORF序列，用PCR的方法扩增出Bph30基因的ORF，全长为3249bp，加A后连入经XcmI酶切的PCXUN载体内。测序验证无误后，所得载体即为Bph30基因过表达遗传转化载体。
将过表达载体导入正常粳稻品种Nipponbare中，最后获得Bph30过表达转基因阳性植株18株。用T1代的植株进行了抗性鉴定。采用苗期集团法鉴定，对照水稻Nipponbare(N)全部死亡，转基因阳性植株正常存活。
根据Bph30基因的基因组序列，用PCR的方法从抗性亲本AC1613中扩增出含有Bph30基因的核苷酸片段，全长为9477bp，在前端和后端分别加上EcoR1和Apa1酶切位点，将Bph30基因的基因组序列分段连入到PCAMBIA1300载体中，测序验证无误后，所得到的载体即为Bph30基因本底表达遗传转化载体。
将本底表达遗传转化载体导入正常粳稻品种Nipponbare中，最后获得Bph30本底表达转基因阳性植株19株。用T1代的植株进行了抗性鉴定。采用苗期集团法鉴定，对照水稻Nipponbare(N)全部死亡，转基因阳性植株正常存活。
证实Bph30基因具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph30可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。
本发明的优点和效果：
1.本基因的成功克隆进一步证实了图位克隆法克隆水稻重要基因的可靠性，该方法克隆的基因其功能明确、效果好。
2.本发明克隆的Bph30基因是一个完全显性的抗褐飞虱基因，纯合基因型和杂合基因型的褐飞虱抗性无差异，可以更好的用于杂交水稻育种。
3.Bph30基因使水稻抗褐飞虱性能大大提高，并且在籼稻和粳稻品种的背景下都具有极强的褐飞虱抗性，这对于水稻品种改良具有重要的意义。
4.通过遗传转化或杂交将Bph30应用于水稻育种中，可以改善水稻品种的抗褐飞虱性，从而减轻褐飞虱的为害，达到增产和稳产的目的。
5.刺吸式昆虫是农业生产中的一大类虫害，Bph30基因克隆和抗褐飞虱功能证实，对于其他植物的抗刺吸式昆虫研究具有重要参考作用。
附图说明
图1为Bph30基因精细定位结果。
A：白色方框表示感性亲本9311的染色体片段，黑色方框表示抗性亲本AC1613的染色体片段；左侧的数字表示对应基因型的重组单株数，右侧的字母表示对应基因型的重组单株的表型；Bph30基因最终定位于分子标记SSR-28和SSR-69之间的20kb区域；经过预测有两个基因，G2和G4；
B：候选基因G4，白色方框方框表示UTR区，黑色方框表示外显子区，直线表示内含子区。
图2为候选基因G4过表达转基因T1代阳性株系抗褐飞虱鉴定结果。
转基因植株放虫后7天的结果；N表示感性对照日本晴Nipponbare，G4OE-2、G4OE-12表示两个转基因T1代阳性株系，当感性对照全部死亡时转基因阳性株系生长健康，说明G4过表达转基因株系对褐飞虱有较强的抗性。
图3为候选基因G4本底表达转基因T1代阳性株系抗褐飞虱鉴定结果。
转基因植株放虫后7天的结果；N表示感性对照日本晴Nipponbare，G4-11、G4-15表示两个转基因T1代阳性株系，当感性对照全部死亡时转基因阳性株系生长健康，说明G4本底表达转基因株系对褐飞虱有较强的抗性。
图4为分子标记辅助选择培育带有Bph30基因的抗褐飞虱籼型水稻品种。
苗期抗褐飞虱鉴定，感性对照籼稻9311，NIL-9311表示9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30的水稻材料，当感性对照9311全部死亡时NIL-9311生长健康。表明NIL-9311对褐飞虱具有较强的抗性。
图5为分子标记辅助选择图培育带有Bph30基因的抗褐飞虱粳型水稻品种。
苗期抗褐飞虱鉴定，感性对照粳稻日本晴Nipponbare(N)，NIL-N表示日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30的水稻材料，当感性对照N全部死亡时NIL-N生长健康。表明NIL-N对褐飞虱具有较强的抗性。
图6为根据抗褐飞虱基因Bph30基因组序列开发的共显性分子标记S7示意图。
AC1613是携带有Bph30基因的抗性亲本，TN1、N、9311为感性材料，Bph30基因内部分子标记S7可以准确的从AC1613与以上三种材料的杂交后代中鉴定出纯合抗性、纯合感性以及杂合基因型的材料，携带Bph30基因的材料高抗褐飞虱。
图7为分子标记S7基因型以及抗褐飞虱表型频率分布图。
A：为抗性材料AC1613和日本晴Nipponbare(N)构建的BC2F2分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；
B：为抗性材料AC1613和台中1号构建的BC2F2分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；
C：为抗性材料AC1613和9311构建的BC2F2分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；
其中a纯合抗性品种的基因型，用黑色柱子表示；b是纯合感性品种的基因型，用白色柱子表示，h为杂合基因型用填充斜线的柱子表示。横轴数值表示褐飞虱在水稻植株上取食48h后的增重变化(单位：mg/48h)，纵轴表示单株数量。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1Bph30基因的精细定位与克隆以及紧密连锁分子标记开发
1.Bph30精细定位结果及分子标记的开发
抗褐飞虱亲本AC1613(来自国际水稻研究所，含抗褐飞虱基因Bph30)与褐飞虱感性水稻品种9311杂交再多次回交构建了含Bph30基因的回交群体，用于筛选重组单株。用定位区间两段的标记RM16290和RM16303筛选回交群体BC2F2，共得到54株重组单株，并根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的标记，以及利用SSRHunter1.3根据日本晴中对应定位区间的序列搜索寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，在重组单株中加密分子标记。采用分蘖期褐飞虱增重法进行抗虫性鉴定，褐飞虱于2006年在武汉田间采集，在TN1稻株上饲养繁殖。分蘖期时按每棵固定三个蜡袋，每个蜡袋中放入一头新近羽化的已知质量的短翅雌虫，48h后称量虫的质量，蜡袋大小为30mm×30mm由Para film膜制作，称量时所用天平为十万分之一精度的天平。
根据重组单株的基因型和表型最终将Bph30基因定位在SSR标记SSR-28和SRR-69之间(如图1)。在参考基因组日本晴的基因组中，两个标记之间的物理距离37.5kb。
2.SSR-28至SSR-69区段候选基因的分析
根据定位区间在日本晴和9311之间进行比对分析，选择保守序列每隔1-2kb进行引物设计，将Bph30基因的抗性亲本AC1613的DNA作为模板进行扩增、测序和拼接。发现在抗性亲本AC1613中，这两个SSR标记之间的物理距离为20kb，说明抗性亲本在该区间存在较大的结构变异，无法用日本晴的基因组序列直接进行基因预测。用FGENESH对抗性亲本AC1613定位区间基因组序列进行基因预测和注解，结果显示该区段含有两个基因，分别命名为G2和G4。候选基因G2的基因组序列和参考基因组日本晴的序列差异较小。G4的基因组序列和日本晴序列比对后发现差异较大，在日本晴中G4的第三个外显子对应的基因组序列中存在一个18kb左右的插入片段。因此，将该基因确定为Bph30。
3.RACE获得全长cDNA
以抗褐飞虱亲本AC1613叶鞘总RNA反转录产物为模板，根据基因预测结果设计引物，扩增出候选基因的一段cDNA序列。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’Full RACE试剂盒，获得了候选基因G4的5’末端及3’末端序列，确定了候选基因G4的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物，扩增获得G4的全长cDNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2。
4.Bph30基因紧密连锁分子标记开发
根据抗褐飞虱基因Bph30的基因组序列，与粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组相应位置的序列比对，本发明开发出能够特异的在籼稻和粳稻中鉴定Bph30基因存在的共显性标记S7，引物序列如下：
正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG
反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT。
实施例2Bph30基因的功能验证和应用
1.遗传转化载体的构建
(1)候选基因过表达载体的构建。所用载体为pCXUN(由美国Ohio State University的王国梁教授提供)，采用XcmI酶切pCXUN载体，将外源片段加A后可以直接连入。
根据RACE的结果，采用PCR的方法直接扩增候选基因G4的ORF，经加A后连入载体。测序验证无误后，所得载体即为候选基因G4的过表达载体。
(2)候选基因本底表达载体构建。根据候选基因G4的CDNA全长信息找到G4在抗性亲本基因组中的全长序列，通过PCR的方法将G4的基因组扩增下来并分段连入PCAMBIA1300载体中，测序验证无误后，所得载体即为候选基因G4的本底表达载体。
2.遗传转化
采用农杆菌介导的遗传转化方法，将上述G4的过表达载体和本底表达载体导入褐飞虱感性的普通水稻品种Nipponbare。
3.Bph30基因转基因功能验证
候选基因G4过表达转化载体和G4本底表达转化载体分别获得阳性转基因T0代植株18株和19株。收获种子后，得到T1代转基因植株，采用苗期集团法对阳性转基因株系进行了抗褐飞虱鉴定。接入褐飞虱7天后，感虫对照品种Nipponbare整株死亡,G4的过表达载体转基因阳性株系(如图2)以及本底表达载体转基因阳性株系(如图3)生长健康，无叶片受害。证实候选基因G4就是Bph30基因，并且具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph30可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。
实施例3分子标记辅助选择带有Bph30基因的抗褐飞虱水稻
本例中利用分子标记进行分子标记辅助选择选育出携带Bph30基因的抗褐飞虱籼稻品种NIL-9311(9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)，具体实施如下：抗褐飞虱亲本AC1613(含抗褐飞虱基因Bph30)与褐飞虱感性水稻品种9311杂交获得F1代，用9311进行回交，利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC1F1进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC1F1用9311进行回交，得到BC2F1；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC2F1进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC2F1用9311进行回交，得到BC3F1；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC3F1进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC3F1用9311进行回交，得到BC4F1；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC4F1进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC4F1用9311进行回交，得到BC5F1；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC5F1进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC5F1用9311进行回交，得到BC6F1；选择在农艺性状上与9311无差异的材料进行加代繁殖，获得BC6F2；并利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)筛选出抗褐飞虱基因Bph30位点纯合的BC6F2，进行加代繁殖，该材料在农艺性状表型上与9311无区别，但其含有抗褐飞虱基因Bph30。利用武汉田间褐飞虱群体进行苗期集团法鉴定，结果显示放虫后7天，对照感性9311明显死亡，而NIL-9311(9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)仍然存活，植株生长健康(图4)。
同时利用分子标记进行分子标记辅助选择选育出携带Bph30基因的抗褐飞虱粳稻品种NIL-N(日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)，具体实施过程同上。利用武汉田间褐飞虱群体进行苗期集团法鉴定，结果显示放虫后7天，对照感性日本晴明显死亡，而NIL-N(日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)仍然存活，植株生长健康(图5)。
由此可以证实抗褐飞虱基因Bph30不受水稻品种遗传背景的限制在籼稻和粳稻遗传背景下都具有极强的抗性。
实施例4分子标记的验证
1.材料：抗性材料AC1613和粳稻日本晴Nipponbare(N)构建的BC2F2回交群体包含50个单株，抗性材料AC1613和籼稻台中1号(TN1)构建的BC2F2回交群体包含50个单株；抗性材料AC1613和籼稻9311构建的BC2F2回交群体包含50个单株；各单株的种子经过浸种、催芽后播种在塑料桶中，生长至分蘖期。
分子标记引物S7，序列如下：
正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG
反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT。
2.方法：CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA。共显性标记S7扩增样品DNA。10μl体系。10μl反应体系包括：10×PCR缓冲液，1.0μl；10mM dNTPs，0.1μl；10μM引物，0.4μl；5U/μl Taq DNA聚合酶，0.2μl和50ng DNA模板。扩增反应在Bioer PCR仪上进行：98℃2min；98℃10s，55℃20s，72℃20s，35个循环；72℃5min。扩增产物用1％的琼脂糖胶分离，电泳后记录分析。
分离群体中各单株的表型用褐飞虱取食48h后增重法来鉴定。收集新近羽化的褐飞虱短翅雌虫，制作30mm×30mm蜡袋并放入雌虫1头，然后将蜡袋绑定至水稻茎秆上，48h后，终止取食。在褐飞虱取食前和取食后，在十万分之一精度天平上虫体重量。取食前后虫体重量之差即为虫体增重量，每个单株上的放虫实验重复3次以上，确保取得精确、可重复的结果。褐飞虱增重0.55mg/48h为界限，增重小于0.55mg/48h的为抗性单株，增重大于0.55mg/48h的为感性单株。
3.结果：用分子标记S7扩增上述两个群体中的单株，由图6的结果表明，在以上三个离群体中能扩增出279bp片段的单株都表现出抗褐飞虱的表型，不能扩增出279bp片段的单株都表现出对褐飞虱的感性表型。图7中可见，褐飞虱取食含有Bph30基因的单株(a和h)时，增重很少，表明含Bph30的水稻单株对褐飞虱有很好的抗性。
由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱基因Bph30，从而大大提高育种效率。
技术特征：
1.水稻抗褐飞虱基因Bph30，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1 所述的基因，其特征在于，所述基因的cDNA 序列如SEQ ID NO.2 所示。
3.权利要求1 或2 所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3 所示。
4.含有权利要求1或2 所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种制备具有褐飞虱抗性的转基因水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多核苷酸通过如权利要求4的表达盒导入出发水稻中，得到转基因水稻。
6.权利要求1或2所述的基因在水稻选育中的应用，其特征在于，所述水稻选育为提高水稻对褐飞虱的抗性。
7.与水稻抗褐飞虱基因Bph30紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为S7；
用于扩增分子标记S7的引物对如下：
正向引物：S7-F: gctcttgtgtttcgctagttatg
反向引物：S7-R: tgtggactgaccgagtttgt。
8.权利要求7所述的分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。
9.水稻抗褐飞虱基因Bph30的分子检测方法，其特征在于，通过权利要求7中所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段，则标志着水稻抗褐飞虱基因Bph30的存在。
10.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于，通过权利要求7中所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段，则标志着水稻品种褐飞虱抗性的存在。
技术总结
本发明提供了水稻抗褐飞虱基因Bph30及其紧密连锁的分子标记。所述水稻抗褐飞虱基因Bph30的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2，所示抗褐飞虱基因Bph30与分子标记S7紧密连锁，可以利用S7筛选含有Bph30基因的抗褐飞虱水稻品种。通过遗传转化和杂交，将Bph30基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。
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