申请公布号：CN110146619A

申请公布日：2019.08.20

申请号：201910499939X

申请日：2019.06.11

申请人：***

发明人：***

地址：***

分类号：G01N30/02(2006.01)I;

摘要： 本发明涉及一种果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，步骤包括：试样制备；提取得到待净化液；多样品同步净化；调试或优化气相色谱质谱检测条件；采用气相色谱－串联质谱分析，使用多反应离子监测模式和内标法定量分析样品中的百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂的含量。其中多样品同步净化是指采用DPX‑RP枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置对多个样品同步进行萃取步骤的同步吸气、吸液、排气、排液。确保不同样品净化处理操作的一致性，并有助于有效缩短样品前处理的时间。

背景技术：

对植物有害的真菌、病毒等病原微生物有8万种以上，全世界的农作物由于植物病害造成大量减产，据联合国粮农组织(FAO)统计，每年农作物因病害损失达10％—15％。化学杀菌剂的使用是防治植物病害的一种经济有效的方法。近年来开发和使用的农用杀菌剂主要有三唑类、甲氧基丙烯酸酯类、氨基酸衍生物类、酰胺类及其他类杀菌剂。这些农用杀菌剂活性高、作用机理独特、对环境友好，被广泛用于粮食、果蔬、经济作物的灰霉病、霜霉病等病害的防治。然而，由于农药安全意识和知识的匮乏，超剂量和超范围使用及不按安全间隔期进行采收等问题，以及对环境土壤的保护和人们身体健康的重视，许多国家都制定了农产品/食品中的限量标准。近几年农产品农药残留检测结果显示百菌清等杀菌剂药物是检出率较高的农药之一，其残留问题日益受到人们的关注。开发高通量和现场实时的快速检测技术，对于保障农产品安全具有重要意义。

目前对于多组分农药残留的分析，主要采用气相色谱，液相色谱或其质谱联用技术进行分离检测。近年气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)得到了较大的推广，其灵敏度高、特异性强。样品的提取多采用振荡均质、超临界萃取、加速溶剂萃取等方法。样品的净化采用凝胶渗透色谱、固相萃取、QuEChERS(参见公开号CN105203661A)等方法进行样品净化。

DPX枪头式分散固相微萃取柱是一种新型的固相萃取技术，通过枪头式装置、分散型树脂萃取技术大幅度地提高了固相萃取速度，同时有效减少了溶剂的用量。DPX枪头式分散固相微萃取柱内部装填分散的吸附树脂，在适当溶剂条件下，特异性吸附目的化合物，经洗净缓冲液洗涤可除去非特异吸附杂质，再用洗脱缓冲液洗脱可使目的样品从相应树脂上分离，完成目的样品的纯化与浓缩。与分散固相萃取法相比，净化效果好，杂质干扰少。DPX枪头式分散固相微萃取柱结合了固相萃取法和分散固相萃取法的优点，对样品中杂质的净化彻底。

检测多个样品时，采用现有分散固相未萃取柱的前处理方式，存在时间长、效率低的问题，多个样品无法同步处理，并且存在因处理操作无法完全一致导致误差的风险。

技术特征：

1.一种果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：步骤包括

(1)试样制备

取果蔬样品的可食用部分切碎、捣碎，均质混匀，密封，作为试样，冰冻保存；

(2)提取

称取试样于离心管中，准确加入毒死蜱-D10内标溶液，加入乙腈，振荡提取，离心取上清液，加入饱和氯化钠溶液和去离子水，作为待净化液；

(3)多样品同步净化

按照步骤(1)和(2)制备若干样品的待净化液，采用多通道固相萃取装置对多个待净化液进行同步净化，净化步骤包括：

(3.1)平衡活化：准备与样品数量相等的DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱，从DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱底端吸取乙腈，然后全部排出，重复1次或多次；

(3.2)取样结合：若干萃取柱从底端吸入步骤(2)中的待净化的样品，继续吸气形成湍流，吸附结合后将液体全部排出；

(3.3)洗涤：若干DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱从底端吸入去离子水，然后将液体全部排出，重复1次或多次；

(3.4)洗脱：若干DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱从底端吸入乙酸乙酯-正己烷混合溶液，将液体全部导出至样品瓶中，静止片刻，让液体分层，另吸取上层液体至内插管中，准确加入环氧七氯内标溶液；

(4)调试或优化气相色谱质谱检测条件；

(5)采用气相色谱－串联质谱分析，使用多反应离子监测模式和内标法定量分析样品中的百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂的含量。

2.根据权利要求1所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：多样品同步净化是指采用多通道固相萃取装置对多个样品进行萃取步骤的同步吸液或吸气或排气、排液的操作，多通道固相萃取装置包括移液机构(1)和试样机构(2)，所述移液机构包括移液孔板(101)、若干个吸气筒(102)和同步件(103)，

所述吸气筒(102)包括外筒(1021)和活塞(1022)，所述活塞(1022)可移动地设置在所述外筒(1021)内，所述外筒(1021)前端设置有气嘴(1023)，在活塞沿外筒内壁外抽时气嘴吸气；所述外筒(1021)固定在移液孔板(101)的安装孔内；若干吸气筒的所述活塞(1022)分别由所述同步件(103)以同一步调抽拉或推进；

所述试样机构(2)包括试样支架(201)、多孔托板(202)、密封压板(203)，所述多孔托板(202)水平腾空设置在所述试样支架(201)上，若干DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱(3)悬挂在所述多孔托板(202)上，所述密封压板(203)上设置有若干接气孔(2031)，在所述密封压板(203)与多孔托板(202)盖合时，若干接气孔(2031)的一端与若干DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱(3)一一对应接通；

所述的多孔托板(202)两端设置有滑套(2023)，所述试样支架(201)具有两根立柱(2011)，两所述滑套(2023)分别对应套在两根立柱(2011)上，并能够沿着立柱(2011)上下滑动以调节多孔托板(202)的高度；

若干吸气筒的气嘴(1023)通过接气管与若干接气孔(2031)的另一端一一对应接通，在所述同步件(103)同时抽拉活塞(1022)时所述若干枪头式分散固相微萃取柱(3)同步吸气或出气。

3.根据权利要求1所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：步骤(5)定量分析采用标准曲线法，采用空白基质液配制标准曲线，以空白的样品净化液配制四个杀菌剂的标准溶液制作校正曲线，称取7份空白样品，按照步骤(1-3)进行前处理，分别配制质量浓度为10、20、50、100、250、500、800μg/L的空白基质匹配标准工作液进行测定，以各杀菌剂的定量离子峰面积与对应的内标毒死蜱-D10峰面积比值为纵坐标Y，对质量浓度X做线性回归，得到各组分农药的线性方程和相关系数；

采用加标回收的方法，以信噪比为S/N＝3确定检出限，以信噪比为S/N＝10确定定量限，结果参见下表，由表可知，在10—800μg/L的浓度范围内，4种杀菌剂的线性相关系数均大于0.999，呈现出良好的线性关系，4种杀菌剂的检出限为0.3—2.3μg/kg，定量限为1.2—6.7μg/kg，显示出较高的灵敏度；

4.根据权利要求1所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：步骤(2)的具体操作：称取10.00g试样，于50mL离心管中，准确加入40μL毒死蜱-D10内标溶液，加入10mL乙腈，置于振荡涡旋器振摇15min，在4000r/min离心10min。准确吸取2.5mL上清液于试管中，加入2.5mL饱和氯化钠溶液和6mL去离子水，作为待净化液。

5.根据权利要求1所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：步骤(3)基于固相萃取的净化步骤是

(1)平衡活化：连接5mL DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱和多通道半自动固相萃取装置，多个萃取柱从萃取柱底端吸入1mL乙腈，反复吸打3次后，静置30秒，将液体全部排出；

(2)取样结合：用DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱吸取步骤(1.2)中的待净化的样品(约12mL)，分4次吸取，每次吸取2.5-3.5mL左右的待净化液，抬离液面，使DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱在待净化液液面以上，然后继续吸气，在萃取柱内形成湍流，静置30秒，结合后将液体排出，然后重新吸液、吸气、静置、排液，重复此操作共4次；

(3)洗涤：萃取柱从底端吸入1mL去离子水，反复吸打3次后，静置30秒，将液体全部排出；

(4)洗脱：从萃取柱底端吸入700μL的乙酸乙酯-正己烷(1:1,V:V)混合溶液，反复吸打3次后，静置30秒，然后将液体全部排出至样品瓶中，静止片刻，让液体分层，吸取上层液体(有机相)300μL至内插管中，准确加入12μL环氧七氯内标溶液，用气相色谱－串联质谱(GC-MS/MS)分析。

6.根据权利要求2所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：所述活塞的抽拉端设置有推片(1024)，所述同步件(103)具有卡住所述推片(1024)的卡槽。

7.根据权利要求6所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：所述若干吸气筒(102)呈线性排列，所述卡槽为条形长槽，呈线性排列的若干推片(1024)分别卡在所述条形长槽内。

8.根据权利要求2所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：所述移液机构(1)还包括作用于同步件(103)的推拉结构，所述推拉结构包括相互啮合的齿条(104)、齿轮轴(105)，齿条(104)连接同步件(103)，齿轮轴(105)驱动齿条(105)推拉同步件(103)，所述齿轮轴(105)配套有旋转手柄(106)。

9.根据权利要求2所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：所述多孔托板(202)设置有定位柱(2021)，所述密封压板(203)上设置有定位孔(2032)，所述定位柱(2021)和定位孔(2032)位置对应；所述定位柱(2021)穿过定位孔(2032)，露出于定位孔(2032)的定位柱(2021)上通过设置锁套(2022)使多孔托板(202)和密封压板(203)对合锁定。

10.根据权利要求2所述的果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，其特征在于：所述若干DPX-RP枪头式分散固相微萃取柱(3)底端为吸气口，顶端设置有可通气的塞盖(301)，所述塞盖(301)顶入与所述密封压板(203)的接气孔(2031)。

技术总结

本发明涉及一种果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，步骤包括：试样制备；提取得到待净化液；多样品同步净化；调试或优化气相色谱质谱检测条件；采用气相色谱－串联质谱分析，使用多反应离子监测模式和内标法定量分析样品中的百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂的含量。其中多样品同步净化是指采用DPX‑RP枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置对多个样品同步进行萃取步骤的同步吸气、吸液、排气、排液。确保不同样品净化处理操作的一致性，并有助于有效缩短样品前处理的时间。

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