随着社会的进步和科技的发展，越来越多有益的或高产的细菌或真菌已经成为人们青睐的对象。近日，北京知识产权法院审结首例微生物专利侵权案件，涉案专利为专利号为201310030601.2（公开号为CN103503780B）、名称为“纯白色真姬菇菌株”的发明专利，其保护了一株自行杂交获得的新的栽培时间短而高产的可食用真菌。
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根据中国专利法第二十五条第一款第（四）项，动物和植物品种不授予专利权。由于微生物既不属于动物，也不属于植物的范畴，因而微生物不属于专利法第二十五条所列的情况。在《审查指南》第二部分第十章9.1.2.1中指出，“只有当微生物经过分离成为纯培养物，并且具有特定的工业用途时，微生物本身才属于可给予专利权保护的客体”。由此可见，在满足一定授权条件的前提下，微生物是可以获得专利权保护的。随着社会的进步和科技的发展，越来越多有益的或高产的细菌或真菌已经成为人们青睐的对象。近日，北京知识产权法院审结首例微生物专利侵权案件，涉案专利为专利号为201310030601.2（公开号为CN103503780B）、名称为“纯白色真姬菇菌株”的发明专利，其保护了一株自行杂交获得的新的栽培时间短而高产的可食用真菌。其涉案专利授权公告的权利要求书如下：1. 一种纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其保藏编号是CCTCC NO：M2012378。该涉案专利专利权人为上海丰科生物科技股份有限公司（以下简称上海丰科）。上海丰科诉称天津绿圣蓬源农业科技开发有限公司等（以下简称绿圣蓬源）未经许可生产并销售涉案专利产品，侵害了涉案专利权。2017年6月22日北京知识产权法院受理了此案，并于2019年12月26日公开开庭进行了审理。该案现已审结，法院根据鉴定机构的鉴定意见1）专利菌株与疑似侵权菌株的Internal Transcribed Spacer （ITS） rDNA序列均与斑玉蕈Hypsizigus marmoreus HMB1（HM561968）的ITS rDNA序列相似度达到99.9%，因此两者均属于斑玉蕈；2）根据特异性975bpDNA片段序列比对，二者特异性975bpDNA片段第1位至第975位序列完全相同；3）根据形态学比对，二者菌盖、菌褶和菌柄的颜色、形状、排列等形态特征基本相同。根据上述比对情况，鉴定组认为，二者属于同种菌株。故被诉侵权产品落入涉案专利的保护范围而判决绿圣蓬源侵犯了上海丰科的专利权。
案件审理过程中，上海丰科认为应当针对涉案专利与被诉侵权产品的基因特异性片段（包括ITS rDNA序列）进行鉴定、比较，绿圣蓬源认为应当针对涉案专利与被诉侵权产品的全基因序列进行鉴定、比较。一审判决中，北京知识产权法院认为：“至少在表面看来，对被诉侵权产品和涉案专利保藏的样本进行全基因序列检测、对比是最准确的方法，但由于涉案专利要求保护的是一种微生物，其基因存在突变的可能，因此即便是同种微生物，其基因序列也可能不完全一致。而对于两个微生物，二者基因序列的相似程度达到何种比例即可认定二者为同一种微生物，这一标准目前在该领域中并未形成共识。”由此，北京知识产权法院确认鉴定机构（北京国创鼎诚司法鉴定所）采用的鉴定方法合理，并最终采信了鉴定意见，判令被告停止侵权，并各赔偿上海丰科经济损失一百万元并赔偿其为制止侵权行为所支付的合理开支八万余元。本案最大的焦点问题亦是难点为菌株鉴定方法，即基于975 bp ITS rDNA的序列比对是否足够支持疑似侵权菌株落入发明专利的保护范围。核心问题首先是疑似侵权菌株与专利权所保护的菌株之间的关系，即两者是否是同一株菌或分离株。从当前的技术水平出发，判断两者是否是同一株菌的最好的方法则是采用全基因组测序进而比对其基因组，若含有高度重复区无法判断或产生测序误差，则至少可以通过比对基因组测序而注释出来的重要功能性基因、调控子、重要的分子标志物、分化性能更高的基因以及ITS rDNA的序列等来做一个综合的判断。而仅仅通过两株菌具有相同的975 bp 的ITS rDNA序列，且根据形态学对比（菌盖、菌褶和菌柄的颜色、形状排列等形态特征）结果相同就推断出两株菌“属于同一种菌株”未免过于武断，而违背了生物学常识。目前，ITS rDNA序列差异通常应用于真菌中系统发育研究，尤其在属内和关系较近的属间关系时是十分有价值的。而以ITS rDNA序列作为分子标记的应用技术的最大限制是有的真菌由于进化顺序、变异，甚至分析方法等原因，在间隔区上表现的差异性较小，不适合属内种及种群的标记【1】。如Schoch等提出rDNA ITS作为真菌的DNA条形码 (DNA barcoding) 以其灵敏、精确、方便和客观的优势作为一种新兴的物种鉴定方法，已经得到广泛应用，但不得不承认如大家所熟知的Aspergillus属中，一些毒株、工业界广泛应用的生产菌株以及医疗菌株，其ITS rDNA序列完全一致而无法区分，因此必须要引入其他分子标记物加以区分【2】。这就是为什么通常做菌株鉴定或分型还会考虑其他的分子标记物。 然而需要强调的是，涉案专利说明书实施例10-11中涉及到的ITS rDNA测序鉴定和RAPD的分析其实验目的是在菌种分类学上与已知菌株进行区分，而并不是区分两株分离株。也就是说本案所关注的问题并不是分类学意义上的菌种鉴定或者亲缘关系的确定，已经进一步上升到如果同属同种，两株菌是否是同一株的问题。简单地说，ITS rDNA序列不同，两待测菌株一定不是同一株菌，而ITS rDNA序列相同，两待测菌株未必是同一株菌。所以仅通过ITS rDNA序列分析是远远不够的。通过文献检索，笔者发现十年前就已经有报道【3】，【4】蘑菇菌丝体单核化的方法和全基因组测序的结果。此外，2018年已公布了第一个纯白色真姬菇（又名斑玉蕈）全基因组测序的结果（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly/1834041），也即意味着分核及全基因组测序并非不可能实现。若仅仅因为该方法不属于国标、行标等标准方法，也不属于经CMA、CNAS认证的检测项目，而不属于常规的检测方法（见判决书第6页），就回避或将该方法排除在外，其做法是不妥的，也不利于科学的进步和专利法平衡专利权人和社会公众利益的立法宗旨。如果认为采用全基因组测序对专利权人不公，那么，以ITS rDNA序列比对的结果又是对社会公众的不公，毕竟专利保护的技术方案实际上并不是“一种具有特定975bp ITS rDNA序列纯白色真姬菇菌株”，而是由保藏号限定的菌株。
本案作为中国第一个关于微生物基因组测序的侵权诉讼，给在后案件审理的参考意义无疑是深远的，因为在此案之前并未发现涉及保护微生物本身的专利侵权案件，故在鉴定方法的确定方面并无成熟先例可循。一审判决中，北京知识产权法院对此问题进行了初步探索，这无疑是具有开创性。其最终采用的鉴定方法也与近年来国家加强对专利权的保护的国策相关，但其仅凭ITS rDNA鉴定和部分形态学特征鉴定的结果做出侵权判定又未免过于武断。该案判决书评述道：不可否认，至少在表面看来，对被诉侵权产品和涉案专利保藏的样本进行全基因序列检测、对比是最准确的方法，但由于涉案专利要求保护的是一种微生物，其基因存在突变的可能，因此即便是同种微生物，其基因序列也可能不完全一致。而对于两个微生物，二者基因序列的相似程度达到何种比例即可认定二者为同一种微生物，这一标准目前在该领域中并未形成共识（见判决书第13页）。上述评论表达了两方面的意思：1、微生物的基因组存在突变的可能性，因此，拿到全基因组序列也可能不完全一致；2、基因组序列达到何种比例或同一性可以认定为同一种微生物。针对问题1，微生物在传代的过程中有发生突变的可能性，但是在没有筛选压力如紫外线，抗生素等等的自发突变频率是非常低的， 自发突变即由于DNA复制、转录、修复时偶然出现的碱基配对错误所产生的突变。自发突变产生的频率（突变率）一般很低，平均每一核苷酸每一世代为10-10～10-9，不能够以一个极低可能性事件的发生而否定基因组测序的合理性、正确性和科学性，按照法院的观点，微生物乃至高等生物存在突变的可能，我们似乎没有办法通过基因组数据追根其源了，这显然是不合理的。站位本领域技术人员的角度，即使全基因测序的结果可能并不能证明疑似侵权菌株为“相同侵权”，但从疑似侵权菌株与专利权保护的菌株ITS rDNA测序结果100%相同（虽然上文阐述了ITS rDNA在种类鉴定通常并不能区分菌株的区别，但在纯白色真姬菇菌株中可能有例外，以本案的ITS rDNA序列（975bp）在NCBI数据库中并未检索到与其100%一致的其他菌株）并结合两个菌株之间相同的性状特征，其大概率仍为“等同侵权”。但在本领域，“相同侵权”的判定标准还未达成共识，更不用说 “等同侵权”了。为了避免回答更难判定的“等同侵权”即下文的问题2，北京知识产权法院做出了“相同侵权”的判定，但其对于鉴定方法的确定过程未免不能让人信服。针对问题2，可能正是作为首例微生物侵权案件更需要去解决和开创的问题。随着科技的发展，微生物乃至基因克隆已经不再像二十年前那么高深莫测，已经有越来越多的专利保护高产菌株或者能产生有益代谢产物的微生物，如果不能给出一个令人信服的鉴定方法，则不能很好地平衡专利权人和社会公众的利益，专利权人对其菌株的保护则变为空谈，并且专利的保护范围也会变得模糊不清。本案中所用的鉴定方法给后续案件的鉴定方法带来一定的不确定性。在此笔者举一个简单的例子，目前在工业界广泛应用的生产菌株无论是细菌如Bacillus subtilis，还是真菌如Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei等，各个公司可能在标准菌株或实验菌株上或多或少地做了基因修饰，如提高产量、降低蛋白酶活性、增强分泌等。如果仅通过ITS rDNA序列和形态的一致性就可断定不同公司的生产菌株是同样的菌株，势必会造成混乱，显然是不符合科学事实的。另外，鉴定机构的鉴定意见中提出其采用基因特异片段检测方法而不采用全基因序列检测方法进行鉴定的理由是，涉案真姬菇具有双细胞核，需要先进行分核操作使其单核化才能进行基因序列检测。而该分核方法不属于国标、行标等标准方法，也不属于经CMA、CNAS认证的检测项目，不属于常规的检测方法，故通过该方法获得的数据和检测报告不能得到CMA、CNAS认证许可。故以此方法获得的数据也无法保证最终鉴定结论的可靠性。鉴定机构需要遵守经CMA、CNAS认证的检测项目或国标、行标，但更要尊重科学飞速发展的事实，在国标行标不能满足现有需求的情况下，应该要大胆创新出一些新的被公众接受和认可的能够解决实际问题的鉴定方法，而不是回避问题，选择一个经不起科学推敲的方法作为证据。目前中国在相当多的领域已经跻身世界前列，尤其在特色领域（如蘑菇栽培），人们的专利保护意识也在不断增强，正所谓科技在进步，专利保护在加强，可是司法鉴定方法却止步不前，将阻碍科学的发展和专利保护的有效性，与专利法的立法宗旨背道而驰。此外，涉嫌侵权方应诉时也可以采用更积极的应对方式。其一，选择鉴定机构时，应通过调研知晓其是否具有分核、全基因组测序的能力；其二，绿圣蓬源未提交任何证据证明采用全基因测序检测方法进行鉴定更为合理，亦未对应当采用该鉴定方法的理由进行充分说明（见判决书第十四页）；其三，如涉嫌侵权的菌株来自现有技术，则可利用现有技术抗辩，如其为在专利申请日前已经制造相同产品、使用相同方法或者已经作好制造、使用的必要准备，并且仅在原有范围内继续制造、使用的，根据专利法第六十九条第二款不视为侵犯专利权，则具有“先用权”。本案菌种鉴定的目的不是进行生物学意义上的菌种分类研究，也就是定位到属或者种，或者分析菌种之间的亲缘关系，而是甄别疑似侵权菌株与专利保护的菌株是否是同一株菌，因此全基因组测序是最有效的方法，尤其是在有模板的前提下可以快速精准地进行拼接与组装，得到有价值的基因组测序结果。鉴定机构提到分离单核菌丝体和全基因组测序有一定的难度，但是2018年已公布了第一个纯白色真姬菇全基因组测序的结果（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly/1834041），其公布时间远早于鉴定机构对该真菌的鉴定时间（判决书第4-5页），因此此序列信息可以为本案的全基因组测序提供非常可靠的参考和模板序列。如判决书所提到的全基因组测序结果比对后，可能会出现一些不同，而这些不同有可能是菌株本身DNA的不同造成，更有可能是测序误差造成。在已经得知大量测序信息的前提下，可以针对出现不同的位置进行特异性的PCR扩增进而再次测序，则可以排除全基因组测序带来的误差。全基因组测序分析与PCR扩增相结合的方法将最大程度上还原了基因组DNA的真实情况，为鉴别疑似侵权菌株与专利菌株的异同提供了夯实的基础和令人信服的证据。2、采用类似亲子鉴定的方法对分化程度较高的等位基因进行分析和比对众所周知，由于染色体携带着父本和母本遗传信息，正常情况下染色体上的等位基因，一个来自于父本另一个来自于母本，这一规律是由孟德尔发现的，亲子鉴定的原理正是孟德尔的遗传定律的应用和体现。根据基因的自由组合定律(又称独立分配规律)，亲本间的基因都是独立遗传的，所研究的基因越多，那么因杂交而得到的排列组合的可能性就越多，其现代生物学解释为：当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，在等位基因分离的同时，非同源染色体上的非等位基因表现为自由组合。若想节约检测成本，我们可以巧妙利用上述定律进行多个等位基因的分析。可以根据文献报道确定几十个分化程度相对较高的真菌的等位基因座进行PCR扩增和比对。通过扩增产物的相似程度甚至排列方式的关系来判断两株菌的关系。最后，笔者也给专利权人在专利撰写和申请时提一点建议：当有一株具有专利性的微生物菌株欲进行专利保护时，我们所要考虑的问题不仅是如何获得专利权，更重要的是要考虑将来如何维权。因为越有价值的专利，垂青的人可能越多。因此，建议专利权人能够为自己的菌株建立清楚的遗传背景，并且知晓自己的菌株与标准株、模式株或者市面上出现较多的菌株之间的差异，并将此特异或特征性区域或Single Nucleotide Polymorphism （SNP）披露在专利文献甚至权利要求中，以公开换取保护，也为后续的菌种鉴定指明了方向，大大降低了菌种鉴定的成本和方法选择等带来的不确定性。在此基础上，进行权利要求的布局，例如涉案专利中，保护菌株的权利要求可以撰写为：1. 一种纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其特征在于，其ITS rDNA的序列如SEQ ID NO: 1所示（注：此处仅为示例，可能不满足专利法26.4关于“支持”的规定）。2. 如权利要求1所述的纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其特征在于，其用如GTCCCGACGA序列所示（注：专利授权文本中未注明序列编号）的引物进行RAPD分析时在凝胶电泳的2kb（注：仅根据图6估算）处有特征DNA条带。 3. 如权利要求2所述的纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其特征在于，所述特征DNA条带的序列如SEQ ID NO: 2所示。4. 如权利要求1所述的纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其特征在于，其β-葡聚糖含量为1~10g/100g，优选4~5g/100g例如4.2g/100g（注：此处仅为示例，并不满足专利法26.4关于“清楚”的规定）。5. 如权利要求1-4任一项所述的纯白色真姬菇菌株Finc-W-247，其特征在于，其保藏编号是CCTCC NO: M2012378。此处仅为举例，事实上还可以根据实施例的数据布置更多的层次，从而在授权时争取更大的保护范围，在侵权诉讼时也更容易有的放矢。
参考文献：
1、ITS 序列分析在真菌分类鉴定中的应用。陈剑山, 郑服丛；安徽农业科学, 2007, 35(13) : 3785 - 3786 ,37922、Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi[J]. Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109 (16): 6241–6246.3、猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究。张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星；中国医药生物技术， 2015 ,10 (2)。4、Genome sequence of the model mushroom Schizophyllum commune, Robin A Ohm et. al., Nature Biotechnology, 2010，28(9).
来源：IPRdaily