1991年,Petrini等将那些生活史的某一阶段或者全部阶段生活在植物组织内,但没有引起宿主明显病变症状的真菌,包括一些潜伏的暂时生活在植物器官或组织内的病原真菌和菌根菌定义为内生真菌。我国植物种类繁多,不同的寄主植物,其内生真菌的种类和数量不同,产生的代谢物质也存在较大的差别。内生真菌在生长过程中会向环境中释放大量的挥发性物质,作为自然界中不同生物间相互作用的媒介,对很多植物病原菌的生长有抑制作用,对杂草有清除作用,还对农林害虫有吸引和驱避甚至杀灭作用。人工合成农药的使用不仅破坏环境,而且造成病原菌、害虫和杂草的耐药性不断增强,而利用内生真菌产生的挥发性物质熏蒸处理是有效的替代方法,因此,研究内生真菌挥发性物质对农业生物防治具有重要的意义。目前对植物内生真菌挥发性物质进行病害防治的研究较多,Strobel研究小组最早在2001年从锡兰肉桂树的枝条中分离获得一株内生真菌白色麝香霉(Muscodoralbus),其产生的挥发性物质混合组分对植物病原真菌和细菌具有广谱杀菌作用,分别测试了其中5类挥发性物质(醇类、酯类、酮类、酸类和脂类)的抑菌作用,结果表明均表现出一定的抑制效果,但没有一种是完全抑菌的,抑菌效果最佳的是乙酸异戊酯。后来该研究成果获得了专利保护,由美国Agra Quest生物技术公司开发成真菌熏蒸剂,用于控制农田土壤病害。由此打开了植物内生真菌挥发性物质抗菌研究的大门,后续研究者又发现了其他产抑菌挥发性物质的植物内生真菌,如木霉(Trichoderma spp.)、多节孢菌属(Nodulisporium sp.)、粘帚霉(Gliocladium sp.)等。
目前麝香霉属是研究较多的一类产抑菌挥发性物质的植物内生真菌,已有超过19种麝香霉被报道,主要分布在澳大利亚、南美洲和东南亚等热带树木和藤本植物中。麝香霉菌产生的气体多为醇类、酸类、酯类、酮类、脂质和烯烃类等。不同的麝香霉产生的挥发性物质种类和产量不尽相同,能够抑制的病原菌类型和能力也存在差异(见表1)。
麝香霉除了对植物病原菌具有抑菌作用外,对线虫也具有抑制效果。Grimme等将白色麝香霉挥发性物质配制成生物混合液,体外试验中,5mL/L生物混合液在24h内能够完全杀死南方根结线虫。温室试验结果表明,经白色麝香霉熏蒸处理后,辣椒、马铃薯等作物土壤中4种线虫数量均显著减少。2016年11月,Marrone BioInnovations生物熏蒸剂MBI-601 EP获美国登记批准。其活性成分Muscodor albus菌株可产生多种化学物质,既能杀死或抑制某些破坏性线虫和害虫的生长,也能够防治特定的植物病害,如根腐病、立枯病、根枯病和黄萎病。除了土壤处理以外,这种新型的微生物农药将会在草坪、林业育苗、采后使用以及种子处理方面有更多的用途。
木霉挥发性物质中研究较为广泛的是具有“椰子香味”的吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮(简称6PP)。最早在绿色木霉培养滤液中被检测到,在木霉属其他种中也陆续被检测到。研究人员在植物中筛选得到内生真菌木霉属,分析并测试了包括6PP在内的挥发性物质及其抑菌活性(见表2)。

从心叶船形果木内生粘帚霉(Gliocladium sp.)检测挥发性化合物环辛四烯对植物病原菌终极腐霉(Pythiumultimum)和大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)均有较好的抑制效果。Singh等从齿舌兰中分离获得一株内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.),对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等8种病原菌均表现出抑制作用,进一步测试具有抑菌作用的挥发性物质为香桧烯、3-甲基-1-丁醇、正丙醇和丙酮。番红花内生真菌锐孔菌属(Oxyporus sp.)EF069产生的抑菌挥发性物质5-戊基呋喃甲醛,能显著抑制胶孢炭疽菌、链格孢、灰葡萄孢和尖孢镰刀菌的生长。Mookherjee等从茄子果实中筛选得到一株有果香味的内生真菌白地霉(Geotrichum candidum),结果表明苯乙醇、乙酸异戊酯和萘是主要的抗真菌活性物质。紫薇内生真菌多节孢菌属(Nodulisporium sp.)CMU-UPE34能有效抑制指状青霉(Penicillium digitatum)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等,分析其挥发性物质后发现其主要成分为1,8-桉叶素和松油烯-4-醇。Tomsheck等也从籼稻内生真菌炭团菌(Hypoxylon sp.)中发现了抑菌挥发性物质1,8-桉叶素。墨西哥丁香叶片内生多节孢菌属菌株GS4d2Ⅱ1产生的6种挥发性物质中2-甲基-1-丁醇对樱桃番茄尖孢镰刀菌病害的IC50值最小,为18.6 mg/L。国内对植物内生真菌挥发性物质抑菌活性的研究起步较晚,主要集中在除麝香霉和木霉以外的其他真菌。徐涛从健康苹果树皮分离得到一批内生真菌,其中培养了8d的链格孢A1 107产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌菌丝干质量的抑制率为82.58%。药用鸦胆子内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)挥发性物质对柑橘青霉(P. italicum)、香蕉弯孢霉叶斑病菌(C. lunata)、水稻纹枯病菌(R. solani)均具有很好的杀菌活性(达70%以上),经过测试,挥发性物质中主要含3-环己烯-1-醇、β-水芹烯、萜品醇和侧柏酮等。陈利军等从构树枯枝中分离到一株产香内生真菌普通瘤座孢(Tubercularia vulgaris),其挥发性物质可造成番茄灰霉病菌菌丝畸形、分枝增多、原生质外渗等,对番茄果实灰霉病的防效72h后达53.62%。草棉内生尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)CanR-46产生抑制大丽轮枝菌的4种挥发性物质,分别为5-己烯酸、柠檬烯、辛酸和3,4-二氢呋喃,其中5-己烯酸对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发的IC50最小,分别为3.5、9.7 μL/L。宋晓宇从杨树上分离出9株具有特殊气味的裂褶菌(Schizophyllum commune),及分离自海南长春花和银合欢的5株具有特殊气味的间座壳菌(Diaporthespp.),其中S. commune ROHY8225b2 和D. apiculatumFPYF3052在24h内对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)抑制率分别为74%和66.7%,对挥发性物质单一成分进行抑菌能力的测定,结果表明乙酸异戊酯、乙酸异丁酯和4-萜品醇的抑菌效果表现最佳。臂形草叶片内生真菌帚枝霉属(Sarocladium brachiariae)HND5菌株内生挥发性物质2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3,4-二甲氧基苯乙烯和石竹烯对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)具有抗菌活性,有效浓度分别为36、60、2900 μL/L。
陈思杰等从枸杞健康根筛选出深色有隔内生真菌(DSE)M1,其产生的挥发物质对枸杞根腐病菌(Fusarium oxysporum)菌丝生长的抑制率最高,为94.10%。枸杞内生嗜线虫镰刀菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4挥发性物质对灵武长枣致腐真菌交链格孢和灰葡萄孢的抑菌率分别达94.34%和95.95%。
目前对植物内生真菌挥发性物质混合物或单组分的除草活性相关研究较少,麝香霉属(Muscodor sp.)、炭角菌属(Xylaria sp.)和炭团菌属(Hypoxylon sp.)[6,45-46]以及红棕孔韧革菌(Porostereum sp.)挥发性物质对植物的毒性研究显示出防除杂草的潜力,内生真菌可以作为杂草熏蒸剂或使用其产生的挥发性物质开发毒性更小的除草剂。由Gonzalez等从墨西哥斯摩巴裂榄中分离获得内生真菌M. yucatanensis,经GC-MS鉴定,挥发性物质主要为倍半萜石竹烯、α-水芹烯、香橙烯和1R,4S,7S,11R-2,2,4,8-四甲基三环[5.3.1.0(4,11)]十一碳-8-烯。从培养基中提取M. yucatanensis产生的挥发性物质混合组分对稗草、番茄和苋菜的IC50值分别为435、112、132 mg/L,除草活性优于除草剂草甘膦(IC50=234.42 mg/L)。炭角菌PB3f3是分离自巴西苏木的植物内生真菌,其挥发性物质主要为罗汉柏烯、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇和1个结构不明的胺,培养至20、30d的炭角菌挥发性物质对籽粒苋和番茄根系生长抑制率分别为27.6%和53.2%,此外,2-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丙醇对2种供试植物的种子萌发和根系生长均有较强的抑制作用,IC50值分别为26.4~130.0 mg/L和4.6~54.3 μmol/L。分离自墨西哥卷柏叶的植物内生真菌花色炭团菌(H. anthochroum),培养至5、10d的花色炭团菌挥发性物质对紫花苜蓿、糜子、红车轴草和籽粒苋的种子萌发、根系生长和幼苗呼吸抑制率均超过40%,对种子萌发的抑制作用显著优于根系生长和幼苗呼吸;桉油醇是培养至5d的花色炭团菌中检出的主要挥发性物质,它和苯乙醇对供试4种植物的3个生理过程均表现出抑制作用,药效与阳性对照草甘膦相当。另外,研究还发现从PDB培养基提取的挥发性物质比菌丝体中提取的挥发性物质具有更强的植物毒性。内生担子菌也能够产生对植物具有毒性的挥发性物质,Wani等报道了从印度番红花分离得到的红棕孔韧革菌(Porostereum sp.)CSE26,3-氯-4-甲氧基苯甲醛是在其挥发性物质中鉴定出具有植物毒性潜能的主要化合物之一,挥发性物质混合组分、3,5-二氯-4-甲氧基苯甲醛和3-氯-4-甲氧基苯甲醛3种处理使拟南芥的鲜质量降低了65%~67%,进一步研究发现,3种处理使拟南芥中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量下降的比例分别在86.8%~95.5%、60.7%~87.4%、5.7%~87.6%。因其较强的植物毒性使拟南芥表现出萎蔫甚至黄化,研究结果可应用于生物除草。
越来越多的证据表明:微生物,尤其是真菌和细菌,会释放出介导昆虫觅食行为的挥发性化合物,引诱、驱避甚至能够杀死害虫。目前对植物内生真菌白色麝香霉挥发性物质在虫害防治中的报道较多,其挥发性物质对西部樱桃实蝇、马铃薯茎蛾、苹果蠹蛾等果蔬采后贮藏害虫均具有较好的防治效果。Daisy等报道从藤本植物Paullinia paullinioides中分离得到内生真菌Muscodorvitigenus,其产生的挥发性物质萘能够有效驱避麦茎蜂成虫。Wang等从樟子松中分离得到的内生真菌小长喙壳(O. minus)和黑曲霉(A. niger)产生的挥发性物质对松树蜂雌成虫具有明显的驱避作用,经GC-MS测定并分析,苯乙酮、乙酰丙酮、十六烷、苯乙醇和肉豆蔻酸异丙酯是主要的驱避物质。Mozūraitis等报道从甜樱桃和酸樱桃果实分离得到库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum),它们产生的挥发性物质丙酸3-甲基丁酯和3-甲基-1-丁醇可以吸引樱桃绕实蝇,用于监测和控制樱桃树上果实的害虫。研究人员测试了挥发性物质对害虫的影响,这些挥发性物质多数来源于植物和人工合成试剂,目前关于植物精油对虫害防治研究较多,花椒叶精油、花椒果皮精油及2种精油挥发性成分芳樟醇对3种储粮害虫(赤拟谷盗、烟草甲和嗜卷书虱)表现出有效的杀虫和驱避活性。He等报道了千里光精油成分香叶醇对相同3种储粮害虫具有显著的驱避效果,其中对烟草甲和嗜卷书虱的LD50值分别为15.82 μg/adult和26.64 μg/cm2。人工合成试剂苯并噻唑在LC50为19.17 μL/L浓度下能够显著降低赤拟谷盗蛹和成虫的重量、繁殖力和卵孵化率,进一步支持苯并噻唑作为高活性化合物的贮藏产品保护作用。研究表明植物内生菌会产生与宿主相同或相似的生物活性物质。1993年,美国化学家Stierle和植物病理学家Strobel最早从短叶红豆杉的韧皮部分离出一株产紫杉醇的内生真菌安德烈亚紫杉霉(Taxomyces andreanae),自此为天然产物的来源提供了一条新的途径。植物精油及其有效成分可以产生抗虫活性,那么植物内生真菌也有极大可能具备相同的功能,一些微生物能够释放芳樟醇、香叶醇和苯并噻唑等挥发性物质,因此提示我们有更多能够产生防治害虫挥发性物质的植物内生真菌有待挖掘发现。植物内生真菌挥发性物质在生物防治方面的应用潜力巨大,尤其作为农药具有较好的开发前景,但是内生真菌挥发性物质应用仍具有很大的挑战,其一是农业环境中挥发性物质气体形式难以长期留存并发挥作用,只能在一定密闭空间中使用,例如温室和保鲜库,且挥发性物质的量较小,生物防治的效果有待加强,可以使用遗传工具,确定涉及抑菌挥发性物质的生物合成途径并过量表达,以适应大规模生产,因此研究中更多将挥发性物质以液体形式应用。
其二是当以挥发性物质的液体试剂作用时,需要评估使用浓度范围,保证植物和人体安全。在果蔬采后熏蒸处理时,一些水果(如葡萄、苹果等)对环境高度敏感,既要达到抑菌效果,又要保护其不受损伤。
其三是研究人员还需要加大对植物内生真菌挥发性物质中新型有机化合物的挖掘及生防活性的验证,目前挥发性物质主要依靠质谱数据库,对新型有机化合物的鉴定需要与核磁等技术相结合,并且扩展其生防活性(抑菌、除草和抗虫),以适应农业复杂的病虫草害环境。