摘要: 近年来，植物病原菌对杀菌剂的抗性问题日益突出，研发具有高效和低毒的杀菌剂一直是研究热点之一。基于酰肼类杀菌剂的母体结构，将异噁唑杂环引入酰肼母体结构中，设计并合成了 5-甲基-4-异噁唑甲酰肼类化合物 2a ～ 2c。初步杀菌活性测试表明，化合物 2a 对葡萄座腔病菌抑制率达 A 级，优于噻呋酰胺。活体杀菌活性测试表明，化合物 2a 对番茄灰霉病菌的 5 d 保护活性抑制率为 40.67% ，有中等的保护活性。
前言
番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌( Botrtis cinerea) 侵染引起的一种真菌性病害，是经济作物番茄上的重要病害，可危害番茄的花、叶片、果实等，尤其是设施栽培的番茄，发病后传播速度极快［1］。对采集收获后的番茄果实也有一定危害，严重时总产量可减产30% ～ 50%［2-3］。番茄灰霉病害属于低温高湿型病害，病原菌生长温度为 20 ～ 30 ℃，湿度持续 90% 以上。截止 2023 年，该病害在我国主要种植区如江苏、山东、河北和云南的发病率呈上升趋势，已成为番茄设施栽培的主要限制因素［4］。
目前，在化学防治方面，主要药剂有百菌清、多菌灵、噻菌铜、咪鲜胺锰盐、苯醚甲环唑、腈菌唑和醚菌酯等，以上药剂可每 7～10d 喷药1次，需连喷 2～3次［5］。施药时喷雾要均匀，并且交替用药，才能达到良好的防治效果［6］。但是，长期大量地使用这些药剂会导致番茄灰霉病产生一定的抗药性。此外，农药残留超标问题也会影响到番茄农产品质量。因此，研发具有高效和低毒的杀菌剂一直是研究热点之一。
另外，甲酰肼类化合物已被广泛应用于农药领域，如 ＲH-5849［7］、噁唑菌酮、咪唑菌酮等［8-11］。本文基于酰肼类杀菌剂的母体结构，将异噁唑杂环引入到酰肼母体结构中，设计并合成了一系列 5-甲基-4-异噁唑甲酰肼类化合物 2a～2c，并测试了其对几种植物病原菌的离体和活性杀菌活性。
1 试验部分
1.1 试剂与仪器
5-甲基-4-异噁唑甲酸、噻呋酰胺( 质量分数为98% ) 、氟唑菌酰胺( 质量分数为 95% ) 、二甲基亚砜，上海毕得医药公司; 马铃薯，南京市鼓楼社区菜市场; 葡萄糖、琼脂，南京姜华化波公司; 葡萄座腔菌( Botryosphaeria dothidea) 、番 茄 灰 霉 病 菌 ( Botrytiscinerea) 、苹果腐烂菌( Valsa mali) ，中国农业科学院微生物菌种保藏中心。
DH-101Z 电磁加热搅拌器，巩义市科华仪器设备有限公司; ＲV8 旋转蒸发仪，德国 IKA 公司; SHBIII 循环水式真空泵，长沙明杰仪器有限公司;ME204 电子天平，梅特勒-托利多仪器( 上海) 有限公司; MPA100-Optimelt 显微熔点仪，美国斯坦福大学研究所; DHG-9030A 电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司; DK-98-II 电炉，天津泰斯特实验仪器有限公司; Bruker-600 MHz 核磁共振波谱仪，瑞士 Bruker 公司; Sorvall ST8Ｒ 离心机，赛默飞世尔科技( 中国) 有限公司; SpectraMax19016 酶 标仪，美国 Molecular Devices ( MD) 公司; Waters G2-xs高分辨质谱仪，美国 Waters 公司; LGJ-12A 真空冷冻干燥机，北京四环福瑞科仪科技发展公司; GHP-300 光照培养箱，上海赫田科学仪器有限公司。
1.2 合成
5-甲基-4-异噁唑甲酰肼类化合物 2a ～ 2c 的合成路线见图 1。
于反应瓶中，加 入5-甲 基-4-异 噁 唑 甲 酸 1.2mmol、取代苯肼 1.0mmol 和无水二氯甲烷10mL，依次加入1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐( EDCI) 1.2 mmol、4-二甲氨基吡啶( DMAP)0.1 mmol，在 25 ℃下 反应 3 h。薄层色谱法( TLC)监测反应完全，反应液浓缩除去无水二氯甲烷，得粗品，快速柱层析［V( CH2Cl2 ) ∶ V( CH3CH2OH) = 15 ∶1］得 5-甲基-4-异噁唑甲酰肼类化合物 2a ～ 2c。
化合物 2a: 白色固体，m.p.130 ～ 131 ℃，收率90% 。1H NMＲ( 600 MHz，CDCl3) δ: 10.19 ( s，1H) ，8.97( s，1H) ，7.90 ( s，1H) ，7.00 ( t，J = 8.9 Hz，2H) ，6.85 ～ 6.72 ( m，2H) ，2.64 ( s，3H) ; 13 C NMＲ( 150 MHz，DMSO) δ: 172.99，161.06，156.45( d，J =232.5 Hz) ，149.13，146.24，115.68 ( d，J = 22.2Hz) ，114.02 ( d，J = 7.6 Hz) ，110.33，12.45; ESIHＲMS calcd for C11H11FN3O2［M + H］+ : 236.083 5，found 236.0839。
化合物 2b: 白色固体，m.p.150 ～ 151 ℃，收率 95% 。1HNMＲ ( 600 MHz，CDCl3) δ: 10.33 ( s，1H) ，9.00 ( s，1H) ，8.57 ( s，1H) ，7.49 ( d，J =8.6 Hz，2H) ，6.90 ( d，J = 8.6 Hz，2H) ，2.66( s，3H) ; 13CNMR( 150 MHz，DMSO) δ: 173.37，161.18，152.95，149.20，128.23，126.79，125.54( q，J =268.7 Hz) ，119.12 ( q，J =31.9 Hz) ，112.24，110.24，12.53; ESI-HＲMS calcd for C12 H11 F3N3O2-［M + H］+ : 286.0807，found 286.0803。
化合物 2c: 白色固体，m.p.103 ～ 105 ℃，收率96% 。1HNMＲ( 600 MHz，CDCl3 ) δ: 10.32( s，1H) ，8.96( s，1H) ，8.77( s，1H) ，7.55( s，2H) ，6.82( s，2H) ，2.63 ( s，3H) ; 13CNMR( 150 MHz，DMSO) δ: 173.35，160.99，153.28，149.15，133.94，120.45，112.35，110.06，99.73，12.51; ESIHＲMS calcd for C12 H11 N4O2［M + H］+ : 243.0882，found 243.0875。
1.3 杀菌活性试验
本试验采用的植物真菌为实验室 4 ℃保存的葡萄座腔病菌、苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌，用马铃薯琼脂葡萄糖作为培养基( 简称 PDA) 。对照药氟唑菌酰胺和噻呋酰胺质量浓度均为 20mg /L。
1.3.1PDA 培养基配制
配制称取 200g 洗净去皮的马铃薯，切成小块，加水煮烂( 煮沸 20 ～ 30 min，能被玻璃棒戳破即可) ，用八层纱布过滤于烧杯中，加入 15g 琼脂、20g 葡萄糖，充分溶解后稍冷却，加水至1000 mL，分装后在121 ℃下灭菌 15 min，冷却后备用。
1.3.2 离体活性试验
采用菌丝生长速率法进行离体活性试验: 将葡萄座腔病菌、苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌在 PDA平板上 25 ℃培养 3 ～ 6 d; 分别将 PDA 培养基加热溶化，冷却至 45 ～ 50 ℃，分别加入 100 μL10 g /L 的葡萄座腔病菌、10 μL10 g /L 的苹果腐烂病菌和 10μL10 g /L 的番茄灰霉病菌，分别制成含20mg /L 葡萄座腔病菌、20mg /L 苹果腐烂病菌和 20mg /L 番茄灰霉病菌的培养基，并分别倒入培养皿中冷却，噻呋酰胺作为阳性对照; 以无菌操作，分别用打孔器在培养 6 d 的葡萄座腔病菌、苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌株边缘( 生长状况尽量一致) 打取圆形菌饼( 直径为 0.50 cm) ，再分别用接种针挑取菌饼并分别转移至含有 PDA 培养基的培养皿的中央位置，然后分别将培养皿倒置于培养箱 ( 28 ℃ ) 中培养; 在不同时间观察测定菌丝的生长情况，采用十字交叉法测得直径并处理数据，离体抑制率( I ) 计算公式见式( 1) 。
I = ［( d1－d2 ) /( d1－5. 0) ］× 100 ( 1)
式( 1) 中，I 为离体抑制率( % ) ，d1为空白菌落直径对照( mm) ，d2为处理的菌落直径( mm) ［11-13］。将初筛抑制率 ＞ 85% 的化合物进行复筛，测试其杀菌半数有效抑制质量浓度( EC50 ) 。
1.4杀菌活性( 活体) 试验
取市场上购买的质地和大小均匀、光滑的番茄果实，先用 500 mL 灭菌蒸馏水洗涤，再用 500 mL 体积分数为 75% 乙醇洗涤，室温阴干。称取适量化合物 2a，以质量分数为 0.2% 聚山梨酯-80 的水溶液配置化合物 2a 的质量浓度为 200 mg /L。对每个苹果表面进行均匀药剂喷雾后，自然阴干。待苹果表面无液体后，以接种针刺穿果皮，果洞深度 5 mm，接番茄灰霉病菌菌饼( 直径为 0.5 cm) ，每个果实接 3 个菌饼，阳性对照为多菌灵，于室内条件下［( 25 ± 2) ℃和 95% 相对湿度］培养 5 d，并计算抑制率。保护效果计算公式见式( 2) 。
保护效果 = ［( d0－d3 ) /( d0－5) ］× 100% ( 2)
式( 2) 中，d3为处理的病斑直径( mm) ，d0为空白对照的病斑直径( mm) ［12-13］。
2 结果与讨论
2.1化合物 2a ～ 2c 以及照药剂噻呋酰胺和氟唑菌酰胺的杀菌活性测定
按照 1.3 节条件，考察了化合物 2a ～ 2c 以及对照药剂噻呋酰胺和氟唑菌酰胺的杀菌活性，结果见表 1～表 2。
从表1 可知，化合物2a ～ 2c 质量浓度为20mg /L 时，对3种植物病原真菌显示出不同程度的杀菌活性，其中化合物 2a 对葡萄座腔菌抑制率为 A 级，优于噻呋酰胺; 化合物 2a 对苹果腐烂病菌抑制率为B 级，优于噻呋酰胺; 化合物 2a 对番茄灰霉病菌的抑制率为 A 级，优于噻呋酰胺; 化合物2b 对番茄灰霉病菌的抑制率为 B 级，与噻呋酰胺处于同一水平。
从表2 可知: 化合物 2a 的 EC50为 0.133 mg /L，化合物 2b 的 EC50为 0.533 mg /L，化合物 2c 的 EC50＞30.000 mg /L，对照药氟唑菌酰胺 EC50为0.591 mg /L。因此，化合物 2a 对番茄灰霉病菌的 EC50 优于化合物 2b～2c 和氟唑菌酰胺。
2.2 化合物 2a 和多菌灵对番茄灰霉病菌的保护活性试验
按照1.4节条件，考察了化合物 2a 和多菌灵对番茄果实活体灰霉病菌的保护活性，结果见图 2 和表 3。
从表 3 可知，化合物 2a 对番茄灰霉病的 5d 保护活性抑制率为 40.67 % ，多菌灵对番茄灰霉病的的 5d 保护活性抑制率为 54. 67% 。
3 结论
设计合成了 3 个异噁唑甲酰肼类化合物 2b～2c，结构新颖、制备方法简便，收率较高，化合物性质稳定。特别是化合物 2a 对于防治苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌和葡萄座腔病菌显示出较好的效果，对防治植物病害有一定潜力。化合物 2b～2c 对供试菌种有一定杀菌活性，将有待于对结构进一步优化。
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姜婷婷1 周能婷1 赏欣语1 马 讯1 杨子辉* ，1，2
( 1． 楚雄师范学院资源环境与化学学院，科学技术研究院，云南 楚雄 675000; 2． 湖南大学化学生物传感与计量学全国重点实验室，湖南 长沙 410082)