菊酸（Chrysanthemic acid）作为天然除虫菊酯和拟除虫菊酯类杀虫剂的核心手性砌块，其规模化供应长期受限于植物提取效率低及化学合成原子经济性不足等瓶颈。近日，华中农业大学吴淑可教授团队取得突破性进展，通过构建基于异戊烯醇利用途径（IUP）的多酶级联反应体系，实现了菊醇与菊酸在微生物底盘中的高效生物合成。该研究分别获得了510mg/L和203mg/L的产物浓度，均为迄今报道的最高水平，为绿色农药前体的可持续生产提供了全新思路。相关成果以“An enzyme cascade for green synthesis of chrysanthemol and chrysanthemic acid: key precursors for pyrethrins and pyrethroids” 为题发表于Green Chemistry。
图1 A simple summary of this study.
拟除虫菊酯类杀虫剂凭借其高效、低毒、广谱等特性，在全球农药市场中占据举足轻重的地位。其生物活性与酸组分的手性构型密切相关，其中含(1R,3R)-菊酸组分的异构体展现出远超其他手性形式的杀虫效力。然而，当前供应体系面临双重困境：天然除虫菊酯高度依赖从生长缓慢且地域受限的除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）中提取，其活性酯含量仅约1.5%（w/w），全球年产量远不及市场需求；而化学合成的拟除虫菊酯则存在反应路径冗长、昂贵的手性拆分步骤繁琐、原子经济性低下及环境负担沉重等问题。
为突破上述瓶颈，研究团队聚焦于异戊烯醇利用途径（IUP）。该途径仅需两步磷酸化反应，即可将廉价底物异戊烯醇（Prenol）高效转化为通用萜类前体DMAPP。相较于传统的甲羟戊酸（MVA）途径，IUP代谢步骤短、ATP消耗低且不干扰宿主中心代谢，被视为萜类绿色合成的理想平台。本研究首次验证了IUP级联在菊醇和菊酸生产中的可行性，通过系统的酶挖掘、途径重构和过程工程优化，实现了产量的突破。这不仅标志着菊酸生物合成领域的重要里程碑，更为开发全生物合成、可生物降解的天然除虫菊酯奠定了坚实基础。
1. 总体设计
本工作确立了以异戊烯醇（Prenol）为单一输入底物的高效生物合成策略，通过在大肠杆菌底盘细胞中集成基因顺序优化、融合蛋白设计及高效激酶SmaThiM 表达等关键技术，构建了高产细胞工厂。研究采用了模块化级联设计：上游模块（IK+IPK）通过两步磷酸化反应将Prenol高效转化为DMAPP；中游模块（CDS+Nudix）介导两分子DMAPP 的缩合与去磷酸化以生成菊醇；下游模块（ADH+ALDH1）则通过连续氧化反应实现从菊醇到菊酸的转化。通过对这三大功能模块的分别优化与组装，成功打通了从廉价底物到高附加值手性砌块的绿色制造路径。
图2 An enzyme cascade for the biosynthesis of chrysanthemic acid with optimized upstream, midstream, and downstream modules.
2. IK的发掘和体外多酶级联合成菊醇
异戊烯醇激酶（IK）是IUP途径的限速酶。研究团队通过基因组挖掘与系统发育分析，从18个同源蛋白中筛选出Serratia marcescens来源的SmaThiM，其对异戊烯醇的比活力（18.7mU/mg）较常规E. coli来源的EcThiM提高了26%。分子对接进一步揭示，其底物结合口袋的有利构象是高催化活性的结构基础。然而，在包含IK、IPK、TcCDS和TcNudix的体外四酶级联体系中，尽管SmaThiM初始酶活更高，却因稳定性较差而迅速沉淀失活。鉴于此，团队转而采用稳定性更优的EcThiM重构体系，并通过精细优化各酶的配比，最终将菊醇产量从痕量水平显著提升至1.2mg/L。
图3 Mining of high-activity IKs and optimization of enzyme ratios in an in vitro multi-enzyme cascade system.
3. 全细胞多酶级联产菊醇
针对体外级联体系菊醇产量仅1.2mg/L 的瓶颈，研究团队转向大肠杆菌全细胞催化策略。首先，将上游模块（包含13种经文献调研或挖掘筛选的IK与IPK组合）与下游模块（TcCDS+TcNudix）分别构建于双质粒系统中共转化，成功筛选出以SmaThiM为IK的最优菌株，使菊醇产量跃升至84mg/L。在此基础上，通过进一步优化载体拷贝数、基因排列顺序，引入连接肽构建融合蛋白，并添加Sumo标签显著提升了TcCDS的可溶性，推动菊醇产量增至198mg/L。最后，引入50%月桂酸乙酯双相萃取体系，并系统优化底物浓度、发酵温度及菌体密度，使菊醇产量达到510mg/L，创下目前微生物合成菊醇的最高纪录。
4. 全细胞多酶级联产菊酸
将菊醇转化为菊酸依赖于TcADH2和TcALDH1的催化作用，但TcADH2在大肠杆菌中极易形成包涵体，严重限制了合成效率。为突破这一瓶颈，研究团队尝试了两套策略：（A）通过稀有密码子替换以减缓翻译速度，或共表达分子伴侣，均有一定效果；（B）在N端融合Sumo标签，该策略显著提升了TcADH2的可溶性表达，使菊酸产量跃升至最优水平。最终筛选出的工程菌株SINSCSAA（共表达SmaThiM-IPK、TcNudix-SumoTcCDS和SumoTcADH2-TcALDH1），在24小时内利用异戊烯醇高效生产出203 mg/L的(1R,3R)-菊酸，其对映体过量值（ee值）>98%，为目前微生物合成菊酸的最高报道产量。
图4 Optimization of TcADH2 expression and application of the optimal chrysanthemic acid-producing strain.
本研究成功将异戊烯醇利用途径（IUP）的应用边界拓展至不规则单萜的合成领域，填补了IUP应用的重要空白，有力证明了人工IUP途径在非经典萜类骨架构建中的巨大潜力。通过构建全细胞多酶级联系统，以廉价异戊烯醇为单一底物，无需繁琐的手性拆分即可获得ee>98%的(1R,3R)-菊酸，其原子经济性显著优于传统化学合成工艺。所获得的菊醇（510mg/L）和菊酸（203mg/L）产量均创下目前微生物合成的最高纪录，充分彰显了该路线的工业化应用前景。这一成果不仅为缓解天然除虫菊酯供应短缺提供了绿色制造方案，也将激发更多IUP驱动的高值萜类产品的细胞工厂构建。
华中农大吴淑可教授为论文的通讯作者，硕士生廖展樾为第一作者，已毕业硕士生陈春岑做了重要贡献。该研究得到了华中农大化学学院滕怀龙教授、园林学院王彩云教授的大力支持，并获得国家自然科学基金、湖北省科技发展专项等项目的资助。