安徽农业大学陈嘉生/盛成旺团队联合江西农业大学、南京财经大学、江苏省农科院在 《植物保护学报》 发表题为RNAi在害虫防治中的脱靶效应及其规避策略的综述论文，系统梳理了RNAi脱靶效应的分子机制分类、影响因素及规避策略，为RNAi技术在害虫绿色防控中的安全应用提供了完整的理论框架与实践指南。
RNA干扰（RNAi）被誉为 "农药史上的第三次革命"，通过引入dsRNA、siRNA等分子精准沉默害虫关键基因，兼具靶标特异性高、环境友好、无残留等优点，已成为农业绿色防控领域的前沿技术。
然而，RNAi的 "脱靶效应"（off-target effect）——即siRNA/dsRNA沉默了非靶标基因，甚至通过食物链传递对天敌、传粉昆虫及水生节肢动物产生非预期毒性——已成为制约RNAi生物农药商业化应用的关键安全瓶颈。
RNAi脱靶效应根据序列匹配程度分为两大类：
1、专一性脱靶效应（序列依赖性） 由siRNA/dsRNA与非靶标mRNA之间的序列互补性引发，包括三种亚类：
1）完全匹配脱靶：dsRNA与非靶标mRNA存在≥15 nt连续互补碱基，直接被Dicer切割产生功能性siRNA；
2）不完全匹配脱靶：dsRNA与非靶标mRNA存在≥9 nt不完全连续匹配，通过部分互补触发沉默；
3）siRNA种子区脱靶：siRNA向导链5'端第2–8位核苷酸（种子区）与非靶标mRNA的3'-UTR互补结合，类似内源miRNA的作用模式。
2、非专一性脱靶效应（序列非依赖性） 由siRNA/dsRNA分子本身的理化性质引发，与序列无关：
1）免疫应答激活：dsRNA被Toll样受体（TLR3、TLR7、TLR8）、RIG-I等识别，激活IFN、TNF-α、IL-6等天然免疫通路；
2）核心组分竞争：外源siRNA与内源miRNA竞争AGO2等RISC核心蛋白，破坏内源miRNA的正常调控；
3）下游基因表达紊乱：RISC饱和、翻译组全局波动，导致数百个非靶标基因的表达变化。
△ 图1. RNAi专一性（A）与非专一性（B）脱靶效应模式图。
1.序列相似度：决定脱靶的核心指标。
dsRNA 与非靶标 mRNA 的序列相似度是判断脱靶风险的首要指标，但阈值因昆虫类群而异：
1）鞘翅目（敏感型）：赤拟谷盗中，dsRNA与非靶标mRNA序列相似度≥78%即可发生脱靶；
2）鳞翅目（耐受型）：棉铃虫、二化螟等需>92%序列相似度才脱靶，且完全匹配片段需更长（>35 nt）；
3）特殊案例：草地贪夜蛾中，同源基因Ef1α与斜纹夜蛾仅有61.7%–77.5%相似度，仍可触发龟纹瓢虫同源基因的沉默。
这表明，不同昆虫的RNAi酶系统（Dicer、AGO等）对序列错配的容忍度差异极大，设计dsRNA时必须针对靶标害虫的类群特性设定阈值，不能一刀切。
2.连续匹配长度：越短越易脱靶。
完全连续匹配长度仅需15 nt即可触发赤拟谷盗的脱靶效应，且匹配长度从15 nt增至21 nt时沉默效率逐步上升；
siRNA种子区仅需7–8 nt与非靶标mRNA完全匹配即可脱靶——例如针对GFP的siRNA，仅需8 nt完全匹配即可沉默水母GFP基因；
siRNA向导链5'端第2–8位核苷酸与非靶标基因3'-UTR的第2–8位核苷酸互补配对，即可模拟miRNA功能引发脱靶。
3.miRNA介导的跨界脱靶
生物系统中广泛存在的miRNA调控网络，使外源siRNA可能意外模拟内源miRNA的功能：
例如果蝇Aedes aegypti的RNAi诱导沉默复合体，即使siRNA与靶标mRNA存在1–2个错配，仍可切割非靶标mRNA；
朱砂叶螨表皮蛋白基因CPR25在转录后，环状RNA–circCPR25/miR-314-317轴可调控其功能——外源dsRNA若意外干扰该轴，将引发多基因脱靶；
稻水象甲的miR-314-317可调控多个靶标基因，外源RNAi可能通过竞争miRNA通路产生不可预测的脱靶效应。
4.RISC饱和效应与免疫激活
1）RISC饱和：高浓度siRNA/dsRNA使细胞内RISC系统过载，外源siRNA与内源miRNA竞争AGO2核心蛋白，导致内源miRNA调控网络紊乱；
2）双链结合蛋白识别：siRNA的热稳定性越高，R2D2蛋白优先结合的稳定性高的那条链越容易被加载为向导链，另一条链被降解——若加载错误，就会沉默非靶标基因；
3）天然免疫激活：dsRNA可激活Toll/IMD免疫通路，上调Defensin、c-Jun等免疫相关基因，导致蜜蜂肠道微生物群紊乱、家蚕生长发育异常。
1.dsRNA 设计参数
1）长度：长链dsRNA虽提高RNAi效率，但增加脱靶概率；
2）浓度：浓度越高，RISC饱和效应越强，非特异性沉默越严重；
3）特异性：靶标基因的二级结构可能遮蔽siRNA结合位点，导致siRNA无法精确匹配，转而结合非靶标位点。
2.基因转录水平
脱靶效应受基因转录水平调控——转录本丰度越高的基因越容易成为脱靶受害者：
赤拟谷盗5龄幼虫中，CYP6BK13转录本丰度14,350个拷贝，而CYP6BQ9仅1,760个；
尽管针对CYP6BQ9的 dsRNA与CYP6BK13序列相似度仅71%（低于通常阈值86%），但因CYP6BK13转录水平高，仍产生了显著脱靶效应；
东亚飞蝗和黑腹果蝇S2细胞中，高表达的持家基因Ef1α同样更易脱靶。
这一发现提示：设计dsRNA时不能仅看序列相似度，还必须评估靶标与非靶标基因的转录本丰度差异。
3.昆虫对RNAi的敏感性差异
1）鳞翅目：中肠碱性环境（pH 9–11）、肠道微生物、核酸降解酶和血淋巴对外源dsRNA的快速降解，使鳞翅目普遍不敏感，通常不诱发脱靶；
2）鞘翅目：马铃薯甲虫、赤拟谷盗拥有高效的系统性RNAi机制（如SID-1跨膜蛋白），dsRNA 降解速率慢，脱靶效应发生率显著高于鳞翅目；
同一昆虫不同发育阶段也存在差异。
4.dsRNA递送方式
1）转基因植物表达dsRNA：靶向精准、不易扩散、脱靶风险较低；
2）喷雾法施用dsRNA：dsRNA易扩散、飘移风险高，且依赖纳米材料包裹递送——这些递送材料本身也可能影响非靶标生物。
1.优化dsRNA序列设计
1）避开同源保守区：靶标基因选取dsRNA时，避开与同源基因高度保守区域，尤其是完全匹配长度>15 nt或相似度>20 nt的区域；
2）避开免疫激活基序：避开已知会诱发脱靶效应的特殊 siRNA 碱基序列，如5'-UGUGU-3'、UGGC和GU基序——在人HeLa细胞中，长度超过30 nt的siRNA会触发强烈免疫反应；
3）降低使用浓度：使用更低浓度或制剂，虽可能减弱靶基因沉默力，但能显著降低脱靶效应；
4）优化设计提升递送效率：dsRNA分子设计时提升自身递送效率，降低所需用量；siRNA自折叠形成类似siRNA的体内递送系统，自发形成更稳定的dsRNA结构，提高稳定性、延长作用时间。
2.化学修饰修饰siRNA/dsRNA
化学修饰可提升siRNA/dsRNA的稳定性，减少dsRNA用量，从而降低脱靶效应：
1）2'-O-甲基核苷三磷酸：在dsRNA合成过程中引入，提高高温、紫外辐射及dsRNA降解酶条件下的稳定性；
2）硫代磷酸、2'-氟、2'-甲基：经修饰的dsRNA沉默效率和致死率显著提升，同时能抵御昆虫唾液中dsRNA核酸酶的降解。
3.精准递送系统
1）转基因植物组织特异性表达：如桑树转化菌Bacillus amyloliquefaciens SH-8工程化改造，靶向美国白蛾V-ATPase基因，使白蛾幼虫取食后畸形；
2）工程菌递送：从桑树中分离的解淀粉芽孢杆菌SH-8，基因工程改造后表达靶向dsRNA，提升递送精度；
3）纳米材料包裹：壳聚糖、层状双氢氧化物纳米黏土、肽纳米材料、花椰菜花叶病毒样颗粒等，有效保护dsRNA不被降解，减少dsRNA初始用量，提高RNAi安全性。
4.生物信息学预测与评估
1）在线预测工具：dsCheck、sRNAscanner、sRNATarget、dsRNAEngineer等工具通过序列比对预测潜在脱靶位点；
2）跨物种数据库：Senthil-Kumar & Mysore构建的跨物种脱靶数据库RNAimmuno，结合转录组熵值模型，进一步提高预测精度；
3）dsOMEG平台：收录29个物种的序列信息，大幅提升dsRNA设计和脱靶效应预测精度；
4）实验验证：任何预测结果都需通过检测基因的沉默效率和蛋白含量来确定是否为真实脱靶。
目前，利用 RNAi 技术防治害虫仍面临脱靶风险、昆虫敏感性差异、dsRNA 不稳定、生产成本高、制剂研发难、非靶标与残留风险、登记审批壁垒等问题。
未来发展方向包括：
1）完善评估体系：建立完善的脱靶效应评估与监控体系，是RNAi技术应用不可缺少的环节；
2）结构生物学赋能：解析Dicer、AGO等核心蛋白与dsRNA/siRNA的三维结构，从原子水平理解切割与装载机制；
3）AI与组学融合：结合生物信息学、转录组学、宏基因组学，系统预测脱靶靶点；
4）递送技术革新：开发更高效、更安全的纳米递送系统，降低田间用量与飘移风险。
RNAi脱靶效应的本质，是RNAi技术从 "实验室基因沉默工具" 走向 "大田生物农药" 过程中必须跨越的安全门槛。只有将脱靶风险控制在可接受的生态学阈值范围内，RNAi农药才能真正实现商业化落地。